噬菌体展示肽库技术淘选蚕丝纤维蛋白连结短肽的实验研究

采用噬菌体随机肽库展示技术研究与蚕丝纤维蛋白连结的功能性短肽的淘选方法.实验结果显示,淘选的与蚕丝纤维蛋白连结的功能性短肽都包含有一个相同的氨基酸残基序列QSWS.噬菌体与蚕丝蛋白的连结试验和合成肽与蚕丝蛋白的连结试验都证实了QSWS序列与蚕丝蛋白连结的重要性.随着对淘选方法进一步改进和优化,这些功能性短肽将有助于对蚕丝进行功能化改造,可拓宽蚕丝在生物材料领域中的应用.     

逆转录聚合酶链式反应快速检测水稻条叶枯病毒

逆转录聚合酶链式反应（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ－ＰＣＲ）具有灵敏度高,准确性好的特点,因而被广泛应用于植物病毒检测。在ＲＴ反应中,ＲＮＡ样品的快速制备尤为重要用异丙醇二步沉淀法获得ＲＮＡ,快速检测水地片中ＲＳｔＶ伯ＲＴ－ＰＣＲ方法,可使测定时间缩短至６ｈ,并可从０．０７８ｍｇ感病叶片中检测出ＲＳｔＶ。     

水稻条叶枯病毒云南分离物（RStV.Y）的纯化与理化特性分析

采用改进的水稻病毒纯化方法，以２００ｇ／Ｌ的蔗糖垫替代蔗糖密度梯度，从ＲＳｔＶ感染的水稻叶片中制备了病毒颗粒，电镜观察显示，ＲＳｔＶ为细丝状和分枝状结构，变性琼脂糖凝胶电泳分析分离纯化的病毒总ＲＮＡ得到４个大小不 同的病毒ＲＮＡ。     

水稻条纹叶枯病毒天津分离物中病害特异性蛋白编码基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR的方法,对水稻条纹叶枯病毒天津分离物的病害特异性蛋白编码基因进行了扩增,将其克隆到pUCm-T载体后进行序列测定与分析.结果表明,该病毒分离物的病害特异性蛋白编码基因的开放阅读框由537个碱基组成,编码的蛋白含178个氨基酸.与GenBank中已有的病害特异性蛋白编码基因进行序列比对,其与分离自北京双桥的SQ、河南原阳的YY、辽宁盘锦的PJ翻译产物只有143位的一个氨基酸的差异.     

胰岛素受体短肽配体的亲和筛选

以高效表达胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-IR)为筛选靶标, 经过一轮酸洗脱和三轮特异性竞争洗脱筛选, 成功地富集了与胰岛素受体结合的重组噬菌体克隆. 随机挑 取噬菌体克隆检测其与胰岛素受体的结合活性, 选取结合力最强的6个单克隆, 测得其与 CHO-IR之间的Ｋ_d值为纳摩级, 表明为特异性结合; 经序列分析表明短肽之 间有明显的基序存在.     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

利用十二肽库筛选心肌型脂肪酸结合蛋白特异性的亲和配体

采用噬菌体表面展示十二肽库对心肌型脂肪酸结合蛋白（H FABP）特异性亲和配体进行筛选, 经3轮筛选及序列比对后得到一个酶联免疫测定分析 (ELISA)检测阳性特征序列： W P N H H M L H K R W P. 对此序列进行肽合成, 并标记上荧光标记物芘, 经高效液相纯化、 冻干及质谱确定其分子量后制成荧光肽探针检测急性心肌梗塞病人血样, 结果均呈阳性. 结果表明, 所获得的肽探针具有较好的临床应用效果.心肌型脂肪酸结合蛋白; 噬菌体表面展示十二肽库; 亲和配体; 酶联免疫测定分析     

心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选

心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种低相对分子质量的蛋白质,其相对分子质量为14 000~15 000,在心肌中含量丰富.H-FABP在脂肪酸的运输、脂类的代谢、调节细胞增殖与分化等方面具有重要的作用,是检测急性心肌梗塞(AMI)的有效生物学标志物.以H-FABP为靶标,采用噬菌体表面展示随机十二肽库对H-FABP的特异性亲和配体进行了筛选,经四轮筛选得到一个ELISA检测阳性特征序列:W-P-H-Q-K-L-H-L-M-R-H-S,为临床检测急性心肌梗塞提供了一种新的方法.     

应用噬菌体随机肽库研究抗溶藻弧菌及其外膜蛋白单抗识别的特异性表位

用噬菌体随机七肽库筛选制备的抗溶藻弧菌及其外膜蛋白的纯化单抗，经3轮淘洗，获得较高程度富集的噬菌体，效价较高，第3轮淘洗比第1轮淘洗的产量高出近百倍。同时获得的阳性噬菌体经ELISA检测能与Va抗原发生强的阳性反应，确证了淘洗筛选的结果。     

水稻黑条矮缩病毒基因组第九组分cDNA的克隆及序列分析

从我国发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒,抽提病毒RNA,利用RT-PCR等手段,获得了病毒基因组第九组分（S9）cDNA克隆。序列分析结果表明：S9全长1900bp,含有2个不重叠的ORF,编码蛋白的分子质量分别为39.9,24.2ku,与日本株S9核苷酸序列同源性为89%,与意大利株MRDV S8同源性为86%。     

ICAM-1特异结合肽的淘选与性质研究

利用噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了随机十五肽库,根据转化率计算库容量为1.36×108.用PCR-SSCP检验了库的异质性.以固相包被亲和淘选的方法,经过4轮淘选和ELISA分析,得到了5个可与重组人细胞间粘附分子1(ICAM-1)特异结合的噬菌体克隆,对所展示的十五肽进行了序列分析.其中活性较高的噬菌体展示十五肽与ICAM-1的亲和常数约为7.87 ×107.     

噬菌体展示肽库技术及其在分子病原细菌学研究中的应用

从噬菌体展示技术的基本原理、肽库的构建、噬菌体肽库的分类、噬菌体肽库的筛选方法等方面,综述了噬菌体展示肽库技术;从抗原表位研究、免疫诊断研究、基因疫苗研究、抗菌药物的靶向投递等方面,阐述了噬菌体展示肽库技术在分子病原细菌学中的应用;并对今后的研究方向进行了展望.     

从噬菌体展示七肽肽库筛选α-淀粉酶特异性配体

为了建立蛋白质亲和配基的高效筛选方法，以淀粉酶为靶分子，利用交替洗脱法从七肽噬茵体展示库中筛选具有高亲和力的噬茵体配体．结果表明，交替洗脱法筛选出的特异性配体的回收率和ELISA信号值均优于酸洗脱法；采用交替洗脱法能够更加有效和迅速地筛选到淀粉酶的高亲和力配体．分析筛选得到的不同噬茵体克隆DNA插入片断的氨基酸序列，发现了可能与配体高亲和性有关的氨基酸残基．     

从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质配基

为了研究噬菌体展示技术的应用，以溶菌酶为靶分子从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质的高亲和力噬菌体配体，所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达0．634．通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列，认为基元HWWW是肽段与酶分子发生亲和的必需序列．此外，由于靶分子和高亲和性展示肽的等电点分别为11．2和6．74，因此在亲和环境中携带异种电荷，利于亲和吸附的发生，而此时低亲和性展示肽与靶分子携带同种电荷，阻碍了亲和吸附．同时，高亲和性肽段HWWPAS和与其有较高同源性的肽段HWTWWNL都有适中的疏水性，这有利于肽与靶分子表面的疏水位点相互作用从而产生亲和吸附．     

多肽的表面展示与结构库

表面展示是一种新的基因操作技术,它使表达的多肽以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞表面,保持相对独立的空间结构和生物活性。该技术可用于研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用,并据此从巨大展示库中选择特定靶功能的多肽结构。常用丝状噬菌体、T₄噬菌体、λ噬菌体以及细胞构建表面展示系统。表面展示库包括重组噬菌体抗体库、随机短肽库、多肽构象库、cDNA展示库和基因突变体展示库。表面展示技术可用于人工抗体和疫苗的制备、抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离、细胞表面工程的研究、多肽药物的研制,以及生物分子实验定向进化等研究。     

Construction of Large Human Single—chain Antibody Phage Display Library

A large human naive single chain antibody (scFv) library is constructed from 60 healthy donors via phage display technique.During the period,some methods are employed to optimize the diversity,such as multi donors,different annealing temperature,half-nest PCR.and assembly by two-way fusion PCR.In this study,78 electroporations resulted in 1010 library,diversity of which is assayed by enzyme fingerprint.The efficiency and diversity are all better than other researches.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

Cε3-Cε4结合肽筛选及鉴定

为了获得免疫球蛋白E(IgE)特异性结合肽,采用固相筛选法,以Cε3-Cε4为靶蛋白,利用噬菌体随机多肽展示技术进行筛选,4轮筛选后,经ELISA鉴定获得19个阳性单克隆噬菌体,阳性率达38％,测序并翻译后共获得11个结合肽.竞争抑制性实验证明P7,P13,P20与Cε3-Cε4蛋白的结合能力较强,细胞水平分析表明:结合肽P7,P20可阻止IgE与其受体结合.本研究将为进一步探索IgE结合肽生物学功能奠定基础,并为设计治疗变态反应性疾病的小分子药物提供参考.