一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片

构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片. 应用多层软光刻技术, 以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料, 盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片. 芯片的大小与载玻片相当, 可同时检测4个样品, 每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室, 每个小室的体积为6 nL. 以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性. 将样品稀释数倍后通入芯片, 核酸分子随机分布在640个小室中并扩增. 核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理, 当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0.5个/小室时, 则每个反应小室包含0个或1个分子. 经过PCR扩增后, 有模板分子的小室检测结果为阳性反应, 而无模板分子的小室为阴性反应, 最后通过计数阳性反应室的个数, 可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数. 实验结果表明, 该数字 PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量, 具有成本低、 灵敏度高、 节省时间和试剂以及操作简单等优点, 为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径, 可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、 单细胞分析、 产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究.     

CRISPR单管等温扩增技术高灵敏检测核酸:以检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA为例

簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas)系统在分子检测领域正在快速发展,在核酸识别上已展现出高特异性、可编程性和多系统兼容性,成为一种极具潜力的分子诊断工具.单独CRISPR-Cas系统检测RNA的灵敏度受到其反式切割动力学限制,因此需要与等温核酸扩增技术联用.将两个体系整合在单管中反应有两种策略:(1)将等温扩增与CRISPR-Cas体系分隔在管内不同位置进行分步反应;(2)在均相混合液中完成核酸扩增与检测.单管检测的关键是对多个反应的兼容性进行研究,从而最大限度地提升两种体系在同一条件下的性能,最后实现超高灵敏、快速、便捷地检测核酸.本文聚焦于基于CRISPR的单管超灵敏SARS-CoV-2RNA检测技术,从方法开发的原理、性能和挑战等多个方面综述了近期的研究进展和发展方向,并指出理解CRISPR-Cas系统的反式切割动力学的重要性.     

芯片毛细管电泳用于人乳头瘤病毒分析的研究进展

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）是一种常见的球形DNA病毒,目前已报道其可以导致6种类型的癌症发生,因此HPV病毒检测方法的研究引起了人们的重视。芯片毛细管电泳（MCE）,作为一种芯片实验设备,结合各种信号放大技术为HPV分型检测提供了简单、快速、高灵敏度和易便携化的检测方法。该文综述了MCE在常规HPV分型检测中的最新研究进展,主要分为MCE技术和MCE结合核酸扩增技术两个部分。综述的第一部分介绍了MCE系统、MCE芯片结构设计和电泳分离方法。典型的MCE系统包含了高压电源、分离芯片、电解液池、进样系统、检测系统等。该文还介绍了近年来应用最广泛的4种芯片通道,包括分离直通道、T型通道、蛇形通道以及双通道,并分别对它们的优缺点进行了比较。第二部分主要介绍芯片电泳在HPV检测中的应用和发展。由于MCE技术的应用,HPV目标物的分离时间,从以前的几个小时缩短到几分钟,极大地提高了分离速度。重点介绍了各种核酸扩增技术结合MCE检测HPV的方法。对聚合酶链式反应（PCR）和MCE结合用于HPV的检测技术、环介导等温扩增（LAMP）技术的HPV检测方法、基于PCR结合限制性片段长度多态性（RFLP）技术用于HPV分型的DNA检测、基于核酸序列扩增（NASBA）技术检测HPV mRNA、巢式PCR等进行了比较分析。其次,对HPV其他检测方法进行了总结,其中包括PCR结合傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）、纳米技术、DNA探针结合电化学方法、亚铜粒子氧化还原锌掺杂的二硫化钼量子点结合T7外切酶电化学发光法和基于CRISPR/Cas12a的环介导等温扩增法。在这些非MCE方法中,电化学传感法,如阻抗法、脉冲伏安法和流动生物传感器,由于背景信号低、时间控制能力强,是一种比较理想的方法。最后,虽然近年来MCE技术得到了发展,所开发的设备得到了应用,但目前在MCE技术、方法和应用方面仍然存在一些挑战。MCE技术在HPV分型检测应用中面临的第一个挑战是,MCE本身无法对HPV核酸进行信号放大,从而不能在HPV的高灵敏和高选择性分析中得到很好的应用。第二个挑战是,虽然有一些研究者已经成功地将PCR和MCE集成在一个芯片上,但该技术的广泛应用仍面临困难,目前仍然没有真正集成的PCR-MCE芯片用于HPV检测。第三个挑战是目前MCE技术无法实现小型化、自动化器件的制造。最后,文章就MCE在HPV分型检测中开发更自动化、更快速以及更稳定可靠的检测技术提出了一些观点和见解,希望能对感兴趣的读者提供一些启发。     

集成式微流控液滴数字化等温扩增用于尿路感染细菌快速检测

数字化核酸分析技术具有不依赖标准品的绝对定量分析能力,因而有利于实现病原分子的快速诊断。现有的数字化核酸分析方法通常采用离线式分析,操作繁琐且耗时较长,难以满足医疗资源有限情况下的检测需求。本研究建立了一种集成式微流控液滴数字化等温扩增方法。采用的微流控芯片集成了序列液滴核酸提取、负压驱动液滴生成和液滴环介导等温扩增(LAMP)功能,可采用集成化方式在1.5 h内完成细菌核酸数字化分析。此微流控芯片对大肠埃希氏菌的核酸提取效率为93.68%±32.38%;使用注射器负压驱动可在4 min内生成约20000个液滴,液滴体积的相对标准偏差(RSD)小于10%;液滴数字化LAMP检测动态范围跨越4个数量级(2.36×10⁴～1.71×10⁷ CFU/mL)。利用本方法检测尿路感染临床标本(n=13)中的大肠埃希菌,与传统定量培养方法结果相比较,本方法的检测灵敏度和特异性均为100%(K_appa=1,p<0.01)。本方法具有操作简便、定量分析准确的优点,为病原体的现场快速检测提供了一种有力的工具。     

发卡型万能传导在基于核酸分子线路的基因诊断中的应用和性能优化

核酸等温扩增技术作为核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定温度下。与聚合酶链反应相比,核酸等温扩增反应具有优异的便携型,因而被视为最有望实现基因快检甚至即时快检的体外基因扩增方法。然而,由于反应过程中假阳性扩增频发、反应后对产物的检测方法缺乏特异性和灵敏度等缺点,限制了其在实际分析检测中的应用。通过构建发卡型结构万能中转探针,成功地将恒温扩增产物转到一套性能良好的已知核酸分子线路上;借助核酸分子线路的百倍放大性能和序列特异性,实现对上游基因序列信息的精准识别和放大信号输出。针对不同的待测序列,仅需改变发卡型中转探针的序列,即可实现对不同序列目标物的检测。基于中转探针的重要性,本研究对中转探针的设计原理和方法进行了重点阐述,提出并验证了一套行之有效的普适性设计规律,确保中转探针良好的中转效率(信噪比)。利用这一规律获得的中转探针,与核酸分子线路偶联,可成功为低至近单分子(20个拷贝)的模型基因提供显著荧光和电化学信号输出。     

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统将核酸提取、PCR扩增与实时荧光检测进行整合,在同一块微流控芯片上实现了核酸分析过程的全自动和全封闭,具有试剂用量少、分析速度快、操作简便等优点。本研究采用微机械加工技术制作集成核酸提取微流控芯片的阳极模,使用组合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片,与玻璃基底通过等离子体键合封装成集成核酸提取芯片。构建了由微流体速度可调节(0~10 mL/min)的驱动控制装置、温控精度可达0.1℃的TEC温控平台、CCD检测功能模块等组成的微全分析系统。以人类血液裂解液为样品,采用硅胶膜进行芯片上核酸提取。系统根据设置好的时序自动执行,以2 mL/min的流体驱动速度完成20μL裂解液上样、清洗;以1 mL/min的流体驱动速度完成DNA洗脱,抽取PCR试剂与之混合注入到反应腔。提取的基因组DNA以链上内参基因GAPDH为检测对象,并以传统手工提取为对照,在该系统平台上进行PCR扩增和熔解曲线分析实验。片上PCR扩增结果显示,扩增曲线明显,Ct值分别为25.3和26.9。扩增产物进行熔解曲线分析得到的熔解温度一致,均为89.9℃。结果表明,此系统能够自动化、全封闭的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR扩增与实时定量分析。     

核酸等温扩增技术在电化学生物传感器中的应用

生物分子检测在临床诊断、基因治疗、基因突变分析等方面变得日益重要,因而,建立简单、快速、灵敏的检测方法具有重要意义。近年,电化学生物传感器因其简单、便携、易操作、成本低等优势在生物分子检测的研究中备受关注。为了提高检测方法的灵敏度,不同的核酸等温扩增技术被应用于电化学生物传感器的构建中。本文简单介绍了电化学生物传感器的工作原理,着重综述了几种主要应用于电化学传感器中的核酸等温扩增技术,同时比较了各方法的优缺点。     

基于CRISPR/Cas技术的传染性病原精准便携化检测系统

以核酸为检测靶向的分子诊断方法是传染性病原体检测的金标准,但将其应用于便携化或现场快速诊断时仍存在多种限制和挑战,如特异性差、操作繁琐和便携化难等。规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）-荧光检测方法有望大幅提升核酸识别的特异性和信噪比。本研究开发了环介导等温扩增（LAMP）-CRISPR/Cas-便携化灰度读取仪检测系统。在CRISPR RNA (crRNA)存在下,利用CRISPR/Cas12a体系实现了对自主设计的甲型和乙型流感病毒核酸LAMP扩增反应体系的精准荧光检测,验证了CRISPR/Cas体系的高选择性和通用性。配套自主开发的便携化灰度读取仪,可同时实现荧光信号的低成本采集和高可靠性可视化判读,检测结束后直接输出样品的阳/阴性结果。利用本检测系统对实际样本进行了分析,验证了其可靠性和实用性,证明了本系统能够实现流感病毒的高灵敏、高特异性便携化分析。     

微流控芯片电泳-多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点

以微流控芯片电泳为检测平台,建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶消化成短片段,再将酶切反应产物与脱氧核糖核酸适配器(DNAadapter)相连;以连接产物为模板,分成两管,分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增;最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象,考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性,采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定结果完全一致。     

双链特异性核酸切割酶等温循环扩增结合 高效液相色谱高灵敏检测双目标microRNA

通过双链特异性核酸切割酶(DSN)循环扩增策略结合高效液相色谱(HPLC)法,实现了对两种疾病标志物microRNA(miRNA)的选择性分离和高灵敏检测.采用酶循环等温扩增策略增强了目标miRNA的信号,提高了HPLC法检测核酸的灵敏度.利用固定在磁珠上的不同长度和碱基序列的DNA探针实现了不同miRNA信号的色谱分...     

一种用于核酸绝对定量检测的高鲁棒性液滴式数字PCR芯片

为满足液滴式数字聚合酶链式反应(PCR)技术对扩增反应过程中稳定保存液滴以及反应后高效检测的核心需求,构建了一种具有过滤气泡和增强荧光信号功能的液滴式数字聚合酶链式反应芯片.该芯片可在10 min内产生20多万个半径约为21μm的液滴.利用"玻璃天花板"的方式构建了独立于芯片主体材料的液滴收集腔,为液滴提供稳定的保存与反应环境;还构建了过滤结构,可有效过滤混入液相中的空气,提高芯片鲁棒性.同时,在液滴收集腔中引入反射层,增强荧光信号,使单个视野荧光成像时间缩短约40%,提高了检测效率.利用该芯片定量检测EGFR基因第21号外显子,检测信号与DNA浓度在10¹～10⁵copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R²=0.998).该方案在载玻片大小的芯片上实现了液滴产生、PCR扩增和荧光信号读取,并具有较高的鲁棒性与检测效率,在核酸检测等方面具有应用潜力.     

A sensitive method for the detection of catecholamine based on fluorescence quenching of CdSe nanocrystals

A sensitive method for the detection of catecholamine based on the fluorescence quenching of CdSe nanocrystals was developed. The sodium citrate-protected CdSe nanocrystals were synthesized in water solution. The fluorescence quenching of CdSe nanocrystals by dopamine, uric acid, ascorbic acid and catechol was studied; the results showed that all of these four kinds of compounds could quench the fluorescence of nanocrystals, and the quenching constant was 6.3 × 10⁴, 2.57 × 10³, 2.14 × 10³ and 1.168 × 10³, respectively. The order of sensitivity for the biosensor was: dopamine > lactic acid > ascorbic acid > catechol. This method shows good selectivity for dopamine, the detection limit reaches 5.8 × 10⁻⁸ M.     

气相色谱-负化学离子源质谱法测定聚氯乙烯塑料中的短链氯化石蜡

建立了用于聚氯乙烯(PVC)塑料中短链氯化石蜡(SCCPs)含量测定的气相色谱-负化学离子源质谱法。采用超声萃取法对PVC塑料中的SCCPs进行萃取,萃取时间为1.5 h;然后用浓硫酸法对萃取溶液进行净化处理;最后用气相色谱-质谱法在负化学电离模式、离子源温度为160 ℃、甲烷反应气流速为1.5 mL/min等条件下对样品中的SCCPs进行定性定量分析。该方法不受样品中中链氯化石蜡(MCCPs)的干扰,可对样品中的SCCPs进行准确的定量分析。分析的12批次样品均检出SCCPs,含量在0.3×10²~3.5×10⁴mg/kg范围内。依据欧盟对SCCP的限值(1%)要求,4批次样品不符合法规要求,不符合率为33.3%。可见,PVC塑料具有较高的SCCPs污染风险。     

Microcells for voltammetry and stripping voltammetry

The designs and applications of "non-flow" microcells in voltammetry and stripping voltammetry for samples with volumes from sub-microliters to 5 ml are reviewed. The analysis of microcell designs was carried out on the basis of their classification: (i) microcells with a static sample, including thin-layer microcells with a static sample; (ii) microcells with forced convection of the sample; and (iii) microcells for batch injection of samples. Two working electrode types (the usual state and inverted state) are discussed. The use of working micro- and mercury-film electrodes and of the accelerated removal of dissolved oxygen are also considered in detail.     

微流控芯片直接化学发光检测方法研究

基于Ru(bipy)₃²⁺的化学发光反应,建立了一种新型微流控芯片化学发光检测方法.以草酸为研究对象,探讨了表面活性剂CTAB的浓度、化学发光反应酸度以及Ru(bipy)₃²⁺浓度等因素对峰形以及检测灵敏度和重现性的影响.草酸的线性范围为1.0×10^-4~5.0×10^-6mol/L,检测限达到2.0×10^-6mol/L.该方法的建立为微流控芯片分离检测某些有机酸、药物、环境物质及核酸等提供了新方法.     

A designed locked nucleic acid-based nanopore for discriminating ctDNA and its coexisting analogue ncDNA

Circulating tumor DNA(ctDNA),carrying tumor-specific sequence mutations,is a promising biomarker for classification,diagnosis and prognosis of cancers.However,there is still a great challenge in discriminating single-base difference between ctDNA and its coexisting analogue(normal circulating DNA,ncDNA)at a serum sample.A locked nucleic acid(LNA)probe combined with a-HL nanopore sensor was designed,which achieved a high signal-to-background ratio(SBR)of^8.34 × 10^3,as well as a significant discrimination capability(~12.3 times)of single-base diffe rence.The accurate discrimination strategy is label-free,convenient,selective and sensitive,which has great potential in the early diagnosis of diseases and biomedical research fields.     

构象转换型传感器对汞、铅、锶离子的同时检测

将核酸构象转换与纳米孔膜技术联用设计了一种新型高灵敏电化学传感器, 实现了对Hg ²⁺, Pb ²⁺和Sr ²⁺的分步同时检测. 使用2种分别能与Hg ²⁺及Pb ²⁺, Sr ²⁺结合的核酸适体, 将其固定在氧化铝纳米孔膜孔道内以阻碍铁氰化钾离子传导. 利用核酸适体包裹目标物时的蜷缩状态与目标物被洗脱剂洗脱后核酸适体的伸展状态之间的构象转换, 控制纳米孔通道的“开”和“关”, 使铁氰化钾溶液的氧化还原电流发生改变. 通过监测铁氰化钾溶液的电信号变化值, 可实现同时检测此3种金属离子的目的. 实验结果表明, 该传感器对3种金属离子具有很高的灵敏度和选择性, 检测的线性范围均为0.051.50 nmol/L, 对Hg ²⁺, Pb ²⁺和Sr ²⁺的检出限分别为0.013, 0.017和0.022 nmol/L(S/N=3).