蛋白质/多肽的微流控二维芯片电泳*

在微流控芯片上构建多维分离系统,为蛋白质组学研究提供了一个有发展前景的高效分离分析技术平台。本文介绍了二维芯片电泳系统耦联模式选取及正交性评价的方法;综述了针对蛋白质/多肽分离分析的各种耦联模式微流控二维芯片电泳分析系统,如胶束电动力学色谱（MEKC）与毛细管区带电泳（CZE）,开管电色谱（OECE）与CZE,等电聚焦（IEF）与CZE, IEF与SDS毛细管凝胶电泳（CGE）, SDS-CGE与MEKC等。特别对二维电泳芯片切换接口的类型进行了分类,探讨了用于微流控二维芯片电泳系统的检测技术,并展望了微流控二维电泳芯片在蛋白质组学研究中的应用前景和发展方向。     

毛细管电泳-质谱联用技术及其在蛋白质组学中的应用

蛋白质组学研究在生物学、精准医学等方面发挥着重要的作用。然而研究面临的巨大挑战来自生物样品的复杂性,因此在质谱（MS）鉴定技术不断革新的同时,发展分离技术以降低样品复杂度尤为重要。毛细管电泳（CE）技术具有上样体积小、分离效率高、分离速度快等优势,其与质谱的联用在蛋白质组学研究中越来越受到关注。低流速鞘流液和无鞘流液接口的发展及商品化推动了CE-MS技术的发展。目前毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦（CIEF）、毛细管电色谱（CEC）等分离模式已与质谱联用,其中CZE-MS应用最广泛。目前被广泛采用的蛋白质组学研究策略主要是基于酶解肽段分离鉴定的"自下而上（bottom-up）"策略。首先,CE-MS技术对酶解肽段的检测灵敏度高达1 zmol,已成功应用于单细胞蛋白质组学;其次,毛细管电泳技术与反相液相色谱互补,为疏水性质相近的肽段（尤其是翻译后修饰肽段）的分离鉴定提供了新的途径。基于整体蛋白质分离鉴定的自上而下"top-down"策略可以直接获得更精准、更完整的蛋白质信息。CE技术在蛋白质大分子的分离方面具有分离效率高、回收率高的优势,其与质谱的联用提高了整体蛋白质的鉴定灵敏度和覆盖度。非变性质谱（native MS）是一种在近生理条件下从完整蛋白质复合物水平上进行分析的质谱技术。CE与非变性质谱联用已被尝试用于蛋白质复合体的分离鉴定。该文引用了与CE-MS和蛋白质组学应用相关的93篇文献,综述了以上介绍的CE-MS的研究进展以及在蛋白质组学分析中的应用优势,并总结和展望了其应用前景。     

基于不同提取方法的水稻叶片蛋白质组的二维液相色谱分离及高分辨质谱分析

建立了酚法提取-二维液相色谱分离-高分辨质谱分析水稻叶片蛋白质组的方法。水稻叶片蛋白质经过酚法提取,酶解肽段脱盐后用离线反相-反相二维液相色谱分离,然后用线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱分析,共鉴定到2712种蛋白质。比较了液相色谱分离系统（一维液相色谱与二维液相色谱）和水稻叶片蛋白质提取方法（酚法、十二烷基硫酸钠法（SDS法）和三氯乙酸/丙酮法（TCA/丙酮法））对鉴定蛋白质数量的影响,结果表明：在二维液相色谱条件下,酚法、SDS法和TCA/丙酮法鉴定到的蛋白质数目为2712、2415和1914,分别是一维液相色谱条件下鉴定到的蛋白质数目的2.7、2.5和1.9倍。二维液相色谱条件下,酚法鉴定到的蛋白质数目比SDS法和TCA/丙酮法分别多297和798。与SDS法和TCA/丙酮法相比,酚法不但鉴定到的蛋白质数量多,而且能够鉴定到一些极端蛋白质,如酸性、碱性及高等电点的蛋白质。此外,对二维液相色谱条件下3种蛋白质提取方法提取到的蛋白质进行生物学功能分类,发现3种方法鉴定到的蛋白质的功能存在互补性,但酚法鉴定到的蛋白质功能种类最多。该法为水稻蛋白质组学研究提供了技术支撑,同时也为其他作物的蛋白质组学研究技术提供重要的借鉴。     

糖芯片的研究进展

糖芯片是生物芯片的一种,如基因芯片对于基因研究和蛋白质芯片对于蛋白质组研究一样,糖芯片在糖组学的研究中同样也将扮演重要的角色。本文系统介绍了糖芯片的制备流程及其应用,以及在糖芯片研发开发中的技术障碍。     

粘土矿物-蛋白质超薄膜的设计与生物催化性能

随着生物芯片及生物大分子有序自组装技术的发展,蛋白质-粘土矿物的超薄复合膜（clay-protein ultrathin films,CPUFs）的制备在生物催化领域引起人们的广泛关注.本文详述了蛋白质（溶解酵素、牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶与精蛋白）与单片粘土（elementary sheet）矿物（钠化皂石）形成单层或多层纳米薄膜复合物的吸附过程及二维分子自组装的制备工艺,对交替层吸附（layer-by-layer,LbL）和Langmuir-Blodgett（LB）方法应用于CPUFs的构筑分别进行了介绍,并阐述了紫外可见分光光度计（UV-vis）,衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）,X射线衍射（XRD）,原子力显微镜（AFM）和界面化学技术等手段对薄膜定性定量表征的研究方法及结果.研究表明,在CPUFs的形成过程中,静电相互作用是一个突出因素,但不是唯一驱动力.在利用LB技术构筑CPUFs的研究中,我们发现即使在无表面活性剂分子的协助下,水溶性蛋白质也能够在粘土矿物稀溶液的界面上形成较为稳定的蛋白质-粘土矿物Langmuir复合膜.通过研究表面压力与时间（？-t）的动力学曲线和表面压力对面积（？-A）的等温线,实现了粘土矿物与蛋白分子吸附过程即CPUFs形成过程的实时监测,并测定出CPUFs中蛋白质含量（NS）、蛋白质分子堆积密度（？？）、单个蛋白质分子在粘土片层上的平均占位面积（？？）及蛋白质在粘土层的饱和吸附量等物理化学参数.通过将界面化学测定结果、光谱学方法测定结果与粘土矿物体相溶液吸附实验结果相比较,发现LB技术实现了单层粘土片（厚度约1.3nm）的吸附与自组装,证明界面化学方法是定量化研究CPUFs的一种有效手段.通过将含有溶解酵素的CPUFs膜用于流水池反应器上进行生物活性检测,考察了其在睾丸酮丛毛单胞菌生长发育过程中的催化性能,结果表明LZ分子被锚固在CPUFs上以后,未发生明显的生物活性失活现象.     

核酸介导蛋白质共价修饰的研究进展

蛋白质是参与各种生理过程的关键生物分子。选择性的蛋白质化学修饰为开发新型生物制药和复杂生物系统中单个蛋白质的功能研究提供了有力工具。核酸作为一种多功能的分子工具,近十年被广泛用于构建选择性的蛋白质修饰策略。在这类策略中,核酸可以：（i）作为模板来辅助反应基团与蛋白质靠近,提高有效反应浓度;（ii）作为导向系统通过结合兴趣蛋白（Proteins of interest,POI）实现共价修饰的选择性;（iii）作为催化剂增强邻近区域的蛋白质修饰反应。该综述着重介绍核酸介导蛋白质共价标记策略的研究进展,并以不同的导向系统为分类,介绍了这类标记策略的发展及主要应用。     

等电聚焦预分离用于肝癌细胞分泌蛋白质组的分级与鉴定

分泌蛋白质组(secretome)是指在特定的时空条件下,细胞、组织等分泌的全部蛋白质。分泌蛋白质组可能包含了大量的疾病诊断生物标志物,因此其相关研究越来越受到重视。分泌蛋白质组的组成高度复杂且浓度范围宽,这对分析方法提出了挑战。建立有效的蛋白质或肽段预分离策略,将有利于分泌蛋白质的高覆盖率鉴定。本研究以肝癌细胞系MHCC97L的无血清培养分泌蛋白质为研究对象,采用一种新型等电聚焦预分离(OFFGEL)系统,考察了肽段水平的分级对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明,分离后各馏分中肽段的等电点分布与理论预测基本一致,每个馏分中单独鉴定的肽段比例接近80%,显示了该系统对肽段的高分辨分离能力。结合生物质谱技术,在肝癌细胞分泌系统中鉴定了2995个蛋白质,显示了该系统在复杂体系蛋白质组研究中的应用潜力。     

《液相色谱质谱联用技术在食品和药品分析中的应用》

随着现代仪器分析的发展,液相色谱质谱联用技术（LC／MS）日趋成熟,并在科研与生产巾发挥了重要作用。该书由三部分组成：第一部分基础理论,介绍了液相色谱和质谱的工作原理、仪器结构及工作条件、LC／MS接口、质谱信息解析;第二部分食品功能成分分析,介绍了LC／MS方法分析食品中的蛋白质和肽、低聚糖、皂苷、核苷、黄酮、维生素、     

亲和毛细管电泳技术在蛋白质-DNA相互作用研究中的应用

蛋白质-DNA的相互作用在决定细胞命运的许多过程中发挥重要作用,对蛋白质-DNA相互作用的分子机制研究有利于对基本生命过程的理解,为相关疾病的临床治疗及药物筛选提供理论指导。另一方面,利用一些已知的蛋白质-DNA相互作用可以帮助开发先进的生物工程和生命分析技术,为相关研究提供有力的技术支持。因此,建立灵敏、快速的分析方法用于表征蛋白质-DNA的相互作用十分重要。高效毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）技术因其超高的分离效率、极低的样品消耗与较短的分析时间等优势被广泛应用于化学、生命科学和环境科学等多个研究领域。其中,亲和毛细管电泳（affinity capillary electrophoresis,ACE）技术已经成为考察分子间相互作用的重要研究工具。这篇文章综述了亲和毛细管电泳技术自建立以来在蛋白质-DNA相互作用分析方面的研究进展,并对经典的研究工作进行了着重介绍,主要包括三方面的内容：（1）亲和毛细管电泳技术简介;（2）利用亲和毛细管电泳技术进行蛋白质-DNA相互作用的基础分子机制研究;（3）利用已知的蛋白质-DNA相互作用发展针对目标分子及目标反应的亲和毛细管电泳检测技术。本文还对该领域的未来发展趋势进行了展望与探讨,提出应从以下两个方面增强亲和毛细管电泳技术的分析能力：（1）充分发挥CE技术样品消耗少和高通量等优势,分别发展针对少量珍贵生物样品的高灵敏检测方法和针对大量未知因素的高通量筛选方法;（2）结合DNA测序及质谱技术快速筛选、鉴定未知的蛋白质-DNA相互作用的精确靶点。     

薄层色谱—质谱联用技术及其进展

概述了薄层色谱同质谱的联用（TLC-MS）技术及其进展，着重介绍了TLC-MS联用技术中的多种接口及已经开始广泛使用的几种较先进的电离方法。     

Novel liquid-chromatography columns for proteomics research

The enormous interest in proteomics research in recent years has inspired many developments in peptide chromatography. Different strategies have been developed to cope with the vast complexity of proteomics samples, trying to provide sufficient degree of separation to be able to exploit fully the potential of protein identification by mass spectrometry (MS). As reversed-phase liquid chromatography (RPLC) coupled to MS is still the method of choice for the analysis of protein digests, many efforts focus on the development of high-efficiency RP methods (e.g., monolithic columns and ultra-high-performance LC). This can also increase the speed and the sensitivity of the analysis of protein digests.As RPLC-MS alone is unlikely to provide sufficient resolution to unravel the composition of highly complex samples comprehensively, multidimensional methods will remain essential in proteome research. In this area, hydrophilic interaction chromatography (HILIC) seems to be a promising alternative to the traditional strong cation-exchange-based methods. Also, HILIC has found application in the analysis of post-translational modifications (e.g., phosphorylation and glycosylation).This review describes recent developments in LC methods for proteomics research, focusing on advances in column technology and the application of novel column materials. Illustrative examples show the possibilities of the new columns in proteomics research.     

选择性反应监测技术在蛋白质组学研究中的进展及应用

选择性反应监测（SRM）技术作为一种重要的定向蛋白质分析技术,通过选择性检测特定母离子和子离子来排除非目标组分的干扰,增强了检测灵敏度和定量准确度,具有选择性高、重复性好、灵敏度高、动态范围宽等优点,已被广泛应用于定量蛋白质组学研究,在生命科学领域发挥着至关重要的作用。本文从分析通量、检测灵敏度、定量方法以及相关软件资源4个方面,对近期SRM技术的研究进展进行了综述。然后,对SRM技术在蛋白质组学研究包括生物标志物验证、蛋白质翻译后修饰研究、生物工程以及信号通路分析等领域中的应用进行了概述。最后,本文对SRM技术的应用以及发展前景进行了展望。     

二维液相色谱切换技术及其应用

多维液相色谱已成为复杂样品研究的重要工具。本文在介绍多维液相色谱原理与方法的基础上,重点讨论了二维液相色谱接口切换技术的近期发展,并对其应用现状进行了总结分析。     

The dynamic range of protein expression: a challenge for proteomic research

Proteomic research, for its part, is benefiting enormously from the last decade of genomic research as we now have archived, annotated and audited sequence databases to correlate and query experimental data. While the two-dimensional electrophoresis (2-DE) gels are still a central part of proteomics, we reflect on the possibilities and realities of the current 2-DE technology with regard to displaying and analysing proteomes. Limitations of analysing whole cell/tissue lysates by 2-DE alone are discussed, and we investigate whether extremely narrow p/ranges (1 pH unit/25 cm) provide a solution to display comprehensive protein expression profiles. We are confronted with a challenging task: the dynamic range of protein expression. We believe that most of the existing technology is capable of displaying many more proteins than is currently achievable by integrating existing and new techniques to prefractionate samples prior to 2-DE display or analysis. The availability of a "proteomics toolbox", consisting of defined reagents, methods, and equipment, would assist a comprehensive analysis of defined biological systems.     

Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes

An efficient method of photoaffinity labeling has been developed based on rationally designed multifunctional photoprobes. Photoaffinity techniques have been used to elucidate the protein structure at the interface of biomolecules by the photochemical labeling of interacting sites. However, the identification of labeled sites within target proteins is often difficult. Novel biotinyl bioprobes bearing a diazirine photophore have contributed significantly to the rapid elucidation of ligand binding sites within proteins, thereby extending conventional photoaffinity methods. This article discusses the synthesis and applications of various photoprobes bearing a biotin, including strategies using cleavable linkages between photophores. The combination of photoaffinity methods with chip technology is also described as a novel entry to rapid affinity-based screening of inhibitors. This review focuses on a rapid and reliable photoaffinity method utilizing diazirine-based multifunctional photoprobes with numerous potential applications in functional proteomics of biomolecular interactions.     

A thousand points of light: the application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics

As proteomics evolves into a high-throughput technology for the study of global protein regulation, new demands are continually being placed upon protein visualization and quantitation methods. Chief among these are increased detection sensitivity, broad linear dynamic range and compatibility with modern methods of microchemical analyses. The limitations of conventional protein staining techniques are increasingly being encountered as high sensitivity electrophoresis methods are interfaced with automated gel stainers, image analysis workstations, robotic spot excision instruments, protein digestion work stations, and mass spectrometers. Three approaches to fluorescence detection of proteins in two-dimensional (2-D) gels are currently practiced: covalent derivatization of proteins with fluorophores, intercalation of fluorophores into the sodium dodecyl sulfate (SDS) micelle, and direct electrostatic interaction with proteins by a Coomassie Brilliant Blue-type mechanism. This review discusses problems encountered in the analysis of proteins visualized with conventional stains and addresses advances in fluorescence protein detection, including immunoblotting, as well as the use of charge-coupled device (CCD) camera-based and laser-scanner-based image acquisition devices in proteomics.     

Towards high peak capacity separations in normal pressure nanoflow liquid chromatography using meter long packed capillary columns

Single shot proteomics is a promising approach to high throughput proteomics analysis. In this strategy, long capillary columns are needed to perform long and shallow gradients to achieve high peak capacity and good peak width for informative mass spectrometric detection. Herein, we report that meter long capillary columns, packed with 5 μm particulate material, can be facilely fabricated based on single particle fritting technology. The long columns could reliably generate high peak capacities of 800 in 10 h long gradients for protein digest separations. The operation was within the pressure range (40 MPa) of the most widely used normal pressure nanoLC systems. Due to the excellent life time (>100 injections) and inter-column performance consistency, the meter long capillary columns reported here should be of practical usefulness in single shot proteomics without the need for ultra-high pressure instrumentation.