Integration and Expression of Human Growth Hormone Gene in Caladium bicolor

Human growth hormone (hGH) gene has been inserted into the plasmid pLGV1103 to give the recombinant plasmid pLB-9. It has been introduced into the agrobacterium containing plasmid pGV3850. The recombinant Ti plasmid pGL198(hGH) has been obtained by homologous recombination. The monocotyledon Caladium bicolor has been transferred with pGL198 (hGH) with the leaf-disk co-cultivation method, and transgenic plants have been regenerated. The results of nopaline analysis, NPT II detection Southern blot and Western blot show that the hGH gene was integrated into the genome of Caladium bicolor, and a 22-kD protein was synthesized in the transgenic plants.     

表达烟草花叶病毒外壳蛋白的转基因烟草及其对TMV的抗性

利用体外重组DNA技术构建携带烟草花叶病毒(TMV,国内流行的普通株)外壳蛋白基因(CP)的中间表达载体,通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒,重组TMV-CP基因被转移至烟草细胞,并获得大量再生的转基因烟草。工程烟草的基因组经Southern印迹法分析证明,CP基因在再生工程株染色体中有1—5个拷贝的插入。分子杂交分析确证TMV-CP基因在转基因株中获得正确表达,其mRNA和蛋白产物的丰度分别达0.005—0.01％及0.05—0.2％。攻毒实验表明90％以上的能表达TMV—CP基因的工程烟草能不同程度地抑制病毒的复制、扩散,并显著延缓,减轻系统病状的发生。有3株工程植株直至花期无病状表现,生长正常。这一抗性作用机制在于转化细胞中的外壳蛋白在病毒侵染早期有效地抑制了入侵病毒颗粒的脱壳,从而阻断病毒的复制。     

利用Ty片段构建高稳定的整合型酵母菌表达载体

本文提出了一种利用酵母转座子Ty因子的新战略.本文中构建的酵母整合型质粒含有TyH25片段,利用这一片段与染色体之间的同源重组,可把质粒上的目的基因带入染色体,并可获得相当稳定的表达.本文还报道了GAL4基因和CUP1基因的稳定表达.脉冲梯度电场电泳(PFGE)揭示,质粒上的同一基因可以整合到不同的染色体上.Southern杂交分析表明,质粒整合的靶位点具有较高的结构相似性;整合后的质粒可以以单拷贝形式,也可以成串排列的多拷贝形式存在.我们还发现,随着整合情况的不同,质粒中同一目的基因在不同转化子中表达的情况也不尽相同.     

人α-干扰素cDNA在转化的烟草植株中表达

本试验成功地将人的α-干扰素cDNA导入烟草细胞中,并得到了产生活性干扰素的转化烟草植株。将人的α-干扰素的cDNA通过平头末端连接的方法插入到植物表达质粒pAP2034中的T-DNA转录子1的启动子及其转录子7的加尾信号间的BamHI位点,构建了重组质粒piG3031,将此重组质粒导入Ti质粒载体pGV3850的T区,利用农杆菌感染叶盘的方法转化普通烟草1551,得到了抗卡那霉素的转化植株。DNA的Southern杂交表明:人的α-干扰素基因随同T-DNA一起整合进了烟草基因组中,新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)的检测表明:转化植株之所以能抗卡那霉素是因为NPTⅡ酶基因表达的缘故。而干扰素的生物活性检测的结果说明转化植株能产生有活性的α-干扰素。     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

化学合成的亮氨酸脑啡肽基因在大肠杆菌中的克隆和表达

化学合成的亮氨酸脑啡肽(LEK)基因与质粒pBR322重组,转化大肠杆菌,经过原位杂交筛选,限制性图谱分析和Southern杂交鉴定,获得一批LEK基因重组体。插入乳糖操纵子(1ac)启动基因控制LEK基因的表达。一个lac转录方向和LEK基因转录方向相同的表达质粒,pLE103,能在大肠杆菌中产生LEK。用放射免疫分析方法检测,LEK的产量可达每毫克细菌蛋白426毫微克。     

玉米醇溶蛋白基因Z_4在双子叶植物龙葵(Solanum nigrum)中的表达

本文将含有玉米醇溶蛋白基因Z_4的玉米基因组克隆插入Ti质粒pTiT_(37)的T-DNA区。用带有此质粒的根癌农杆菌感染龙葵,得到了能合成胭脂碱的转化愈伤组织和转化植株。DNA分子杂交和RNA点杂交表明,Z_4基因确实转化并整合进了龙葵的核基因组,并且被转录成mRNA。但在转化体中,没能检测出玉米醇溶蛋白。实验证明,单子叶植物基因的启动子能够在双子叶植物中发挥功能。文中讨论了Z_4基因在双子叶转化植物的种子中受发育调节的可能性。     

大豆致瘤及基因转移研究

本文报道了致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的15个菌系对大豆的致瘤作用,筛选出致瘤效果较好的7个菌系.从野生大豆、半野生大豆和栽培大豆的1553个品种和品系中筛选出94个结瘤品种和品系,占筛选总数的6%,并获得了无菌愈伤组织.经生化鉴定证明,上述愈伤组织中有一部分含有胭脂碱(nopaline),证明Ti质粒可以做为载体,把胭脂碱基因转移到野生大豆、半野生大豆和栽培大豆的基因组中去整合和表达,并稳定地保存在大豆基因组中。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP2在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法,克隆肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)SHZH03株外壳蛋白VP2基因,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP2,经序列测定证实α-factor信号肽和VP2的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导筛选到高效表达VP2蛋白的工程菌株.用饱和硫酸铵法对重组蛋白VP2进行了较好的纯化.Western Blot分析表明,重组蛋白VP2具有较好的反应原性,从而为发展EV71快速、高效、廉价诊断试剂奠定了基础.     

重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.     

电脉冲介导的基因转移——哺乳动物细胞的瞬间表达和稳定转化

本文使用电脉冲介导的基因转移技术,研究外源基因在哺乳动物细胞中的表达,结果成功地将Px1TK质粒,PSV2Neo质粒和含有人膀胱癌基因的PUCEJ质粒分别导入MLTK~-细胞和NIH/3T3细胞。获得了MLTK~-细胞的瞬间表达和稳定转化;NIH/3T3细胞的稳定转化和恶性转化。瞬间表达率达80％,稳定转化率约10~(-4)。用分子杂交检测外源基因在转染细胞中的整合情况以及裸鼠接种检测恶性转化细胞的致瘤性,均获得了阳性结果。     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础.方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染 HEK 293T细胞包装病毒.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达.结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400 by插人片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×10～8 pfu/mL;重组病毒感染后,HEK 293T细胞中IL-16mRNA和蛋白质均有表达.结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK 293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础.     

重组鼠疫汉坦钩端多抗原位点同源合成基因的表达及活性鉴定

将人工合成的含鼠疫耶尔森氏菌的2个抗原位点、汉坦病毒的5个抗原位点和钩端螺旋体的5个抗原位点的串联基因片段克隆到原核表达载体pET-20b中,构建重组表达质粒pET-rYHL.转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株.表达菌株经IPTG诱导后,可高效表达带组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白.包涵体蛋白经尿...     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

化学与酶促相结合合成人生长激素基因

根据人生长激素(hGH)的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏好性, 全面优化hGH的密码子, 添加表达调控元件后合成序列的全长为1040 bp, 采用化学方法拆分成30条单链寡核苷酸. 采用改进的两步法拼接成全基因, 得到2个全序列正确的基因. DA-PCR和OE-PCR拼接产物经T7核酸内切酶Ⅰ处理, 合成基因中的碱基错误率降低了93.93％.     

人乙肝病毒表面抗原基因在转基因烟草中的表达

本文报道了将乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原基因导入植物中并得到了表达。将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体pRoK Ⅱ的CaMV 35S启动子下游,构建重组质粒pRoK Ⅱ-HBs ag,将此质粒导入农杆菌LBA4404中,利用农杆菌感染叶盘的方法转化烟G-140品种,得到了抗卡那霉素的转化植株,并进一步获得了后代植株。酶联免疫分析表明转化植株及其后代均能产生具免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBS Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒。本文显示了用植物廉价生产HBs Ag的可能性。     

普鲁兰多糖为骨架的新型阳离子非病毒基因载体

通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI, 分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上, 合成了新型基因载体P-PEI. 利用 ¹H NMR、 FTIR、 粒度仪、 Zeta电位仪、 透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA 的复合物进行了表征. 凝胶阻滞实验结果证明, 载体P-PEI在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA, 并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解. 噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、 绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及荧光素酶表达质粒(pGL3)转染实验结果表明, 载体P-PEI在N/P高达12.5时对细胞MCF-7, HeLa和COS-7的毒性低于PEI; 当N/P 为6.25时能有效将pGFP和pGL3带入Hela 细胞并表达, 最佳转染效率及荧光素酶活分别为, 比Lipo 2000[(49.13±0.61)%, (58.47±7.62)×10⁸ RLU/mg蛋白) 略低. 因此以Pullulan为骨架材料的P-PEI是一种新的有潜在应用价值的非病毒基因载体.     

应用农杆菌Ti质粒系统将外源基因转入籼稻细胞研究

本文证明经复合酚类化合物预处理的菌株与籼稻培养细胞在普通培养液。特别是在复合诱导培养液(培养过番茄下胚轴切段、胡萝卜细胞及农杆菌的培养滤液)中共培养时,均可发现有较多的细菌附着于水稻细胞表面,并且菌体周围有纤维丝的形成。在复合处理组中,位于pGV3850::1103neo嵌合质粒T-DNA上的NPT Ⅱ基因及NOS基因在籼稻培养细胞中获得了转移与表达。Southern blot分析证明了外源基因整合到受体细胞的基因组中。     

Ti T—DNA基因在天仙子+烟草体细胞杂种培养细胞中的导入、表达及再生

携带章鱼碱型Ti质粒和胭脂碱型Ti质粒的根癌农杆菌不同菌株分别与天仙子+烟草体细胞杂种培养细胞经共培养离体转化程序后,Ti T-DNA基因在受体细胞中获得了转移与表达。虽然细菌处理对受体细胞的植板率具有一定的影响,但其激素自主型频率为33.9—76.8％,表现冠瘿碱合成酶活性的频率为9.7—47.5％。从转化细胞克隆再生的苗不易长大、难于生根,且其基部产生大量的次生瘤组织。在这种再生苗的叶组织及次生瘤组织中仍可检测到相应冠瘿碱合成酶的活性。     

由卫星互补DNA单体构建的抗黄瓜花叶病毒的烟草基因工程植株

本文将合成的卫星RNA-1的全长cDNA单体重组到含CaMV-35S启动子的植物表达载体ROK_2上,并将此重组质粒转入含Ti质粒的根癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中,用以感染我国推广烟草品种G-140的叶圆片并再生成植株。经CMV强毒分离物接种后,大部分转化植株有大量卫星RNA表达,并表现出症状的减轻。第二代转基因植物仍保持大量卫星RNA的表达及对CMV的抗性并出现基本符合孟德尔遗传规律的分离。经分离和选育我们可得到纯化的抗病毒品种。