PMI基因为筛选标记的抗旱表达载体构建

利用PCR克隆了大肠杆菌(Escherichia coli.)6-磷酸甘露糖异构酶(pmi)并进行了序列测定,序列分析表明,该片段与已经报道同源性为98.9%,推导的氨基酸序列与报道的同源性为100%.将该基因替换植物表达载体pCAMBIA130l中的潮霉素抗性基因,成功构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301DP,为抗旱转基因育种奠定了物质基础.     

水稻OsRhoGDI2基因RNA干扰载体的构建

水稻OsRhoGDI2是通过酵母双杂交筛选到的小G蛋白Rho家族成员OsRacD互作蛋白的编码基因,为了研究OsRhoGDI2与OsRacD的相互作用及其在水稻发育中的功能联系,本研究基于序列比对的提示,选择了OsRhoGDI2基因长度为285 bp的特异区段,分别以正向和反向插入中间载体pKANNIBAL中,并亚克隆...     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

柑橘CsPRP4基因RNAi载体的构建

富含脯氨酸蛋白4(PRP4,proline-rich protein 4)是一类响应胁迫并在细胞发育过程中起作用一种细胞壁蛋白。用RT-PCR克隆柑橘CsPRP4基因的正、反义cDNA序列,分别连接到T载体pMD–19T上;经限制性核酸内切酶2次双酶切,将CsPRP4基因的正、反义片段定向连接至双元质粒pFGC5941查耳酮合成酶A(CHSA)内含子的两端,构成反向重复序列;经菌液PCR和测序验证,成功构建了CsPRP4基因的RNA干涉载体;经农杆菌介导法转化柑橘,转基因植株具有明显不同于对照的表现型,研究为进一步阐明CsPRP4的功能奠定了基础。     

多基因双T-DNA植物表达载体的构建及拟南芥转化

多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略. 双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式. 为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物,构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD,其中含有一个抗除草剂基因bar, 3个抗逆相关基因(DREB1A, Na+依赖性Pi转运体基因（d5）, betA)和一个报告基因gfp. 利用农杆菌介导法将该载体转入拟南芥,获得了多基因共转化及去除标记基因的转基因拟南芥. 可将此植物表达载体进一步用于作物的遗传转化.     

半胱氨酸蛋白酶基因RNA干扰表达载体的构建及油菜的遗传转化

将半胱氨酸蛋白酶基因(Bncp5)cDNA序列片段正反向插入表达载体pFGC5941中,构建了RNA干扰表达载体pFGC-Bncp5-RNAi.采用根癌农杆菌介导法,转化甘蓝型油菜下胚轴.在5mg/L BastaMS培养基中筛选,PCR鉴定结果显示,获得Bncp5转基因植株28株.半定量PCR分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因在转基因油菜中表达受到一定程度的抑制,表明Bncp5的干扰载体在油菜中得到表达.     

大鼠HPRT基因敲除载体的构建

根据已知大鼠HPRT基因的外显子序列,从大鼠HPRT基因BAC中用酶切和PCR方法分别分离得到用于构建基因敲除载体的3.0kb和1.7kb的长臂(LongArm,LA)和短臂(ShortArm,SA),并克隆到pSL1180和pKO中.3.0kb长臂片段包含5′端部分序列和exon1部分序列,1.7kb短臂位于exon6和exon7之间.依次将neor、SA、LA克隆到pBS相应酶切位点,得到pBS-HPRT,再将LA-neor-SA片段由pBS中切出,克隆到pKO的KpnI和NotI位点之间,得到大鼠HPRT基因敲除载体pKO-HPRT.     

拟南芥HKT1基因pCAMBIA载体构建及转基因材料筛选

探索盐胁迫作用机理并将其运用到农业生产领域中,对培育耐盐作物具有非常重要的现实意义.土壤环境中过量的Na+会干扰植物根对其他离子的吸收,导致植物生理代谢紊乱、离子失衡.在拟南芥中,已有研究证明HKT1基因在盐胁迫信号通路中扮演十分重要的角色,控制着Na+的吸收、转运和储存.文章通过正向和反向遗传学手段,发现一个转录因子...     

NP1和GAFP双价抗病基因植物表达载体的构建

防御素对病毒、细菌和真菌都具有一定的抗性.天麻抗真菌蛋白可抑制多种真菌的生长.笔者利用DNA重组技术,将这两个抗病机制不同、抗菌谱均较广的抗病基因（天麻抗真菌蛋白GAFP和防御素NP1基因）构建在一个植物表达载体pBinGAFP-NP1上,为一次性地获得含双价抗病基因的植株奠定了基础.     

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘（Citus reticulate）的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR. 通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株. 这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.     

甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri fad2基因片段克隆及hpRNA植物表达载体的构建

首先利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和Lesquerella fendleri基因组DNA中分别扩增出Δ12-脂肪酸去饱和酶fad2基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出相应的小片段,然后将同一基因的大小片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的napin启动子和nos终止子之间,构建成可以在种子中转录表达发夹RNA(Hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体.     

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

Cloning, construction of prokaryotic expression vector and expression ofEscherichia coli cytosine deaminase gene

Cytosine deaminase gene ofEscherichia coli strain H-30 was cloned, and its initiation codon of ‘GTG’ was mutated to ‘ATG’ by PCR. Prokaryotic recombinant expression vector pBV220-CD was constructed. Clone with high enzyme activity were selected by detecting their specific activity of cytosine deaminase. 5-FC(5-FC, 5-fluorocytosine) could induce the lethal toxicity to cells containing active CD gene. DNA sequence analysis indicated that there were 16 altered bases and 5 of them resulted in the alteration of amino acids in predicted peptide by comparing DNA sequence of the clone H-30-CD-11 with high enzyme activity with CD gene reported in Gene Bank.     

新型肠毒素蛋白SElK编码基因的克隆测序、生物信息学分析和表达载体构建

采用微波加热法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,根据NCBI上登录的肠毒素基因sek设计引物,PCR克隆selk基因,对selk基因测序并进行生物信息学分析,在此基础上构建重组表达质粒p ET-32a(+)-selk.测序结果表明本研究克隆得到具有正确编码序列的新型肠毒素selk基因;Protparam分析表明在一级结构水平上该蛋白具有较高的热稳定性;亲疏水性分析表明SEl K蛋白是一个亲水性较高的蛋白质;同源建模表明SEl K蛋白的domain B结构域缺乏传统肠毒素所具有的胱氨酸环,但SEl K蛋白domain B中β-折叠片数量比传统肠毒素更高.这些结果为进一步研究SEl K蛋白的结构与功能奠定基础.     

日本脑炎病毒(JEV)prME的克隆及其植物表达载体构建

为研究乙脑亚单位口服疫苗,根据Genbank已发表的日本脑炎病毒（JEV）prME基因序列,设计引物,PCR扩增出5锚含有Kozak box,3端含有SEKDEL编码区的prME,克隆入pMD18-T载体中,经过序列测定后,用SnaBI和BamHI酶切消化将prME克隆入用EcoICRI和BamHI酶切消化的质粒pBI121 CaMV35S启动子和NOS终止子之间形成一个表达盒,再用HindⅢ,EcoRI酶切消化将该表达盒克隆入相同酶切的质粒pCAMBIA1301中,获得含有prME的植物双元表达载体．     

Polycistronic strategy for cyanobacterial expression vector construction: Co-transcription of a human gene and a selective marker gene

A polycistronic expression vector, pKGA-NTF1, was constructed for the cyanobacterium. Within this vector, the spectinomycin/streptomycin resistance gene (aadA) facilitated the selection of transformants when co-transcribed with favorite genes. A natural glnA gene was selected as the platform to introduce the plasmid into a neutral site of the Synechococcus sp. PCC 7002 chromosome. Function of the vector was demonstrated by the insertion of a modified human Trefoil factor 3 gene (NTF1) to upstream of the aadA gene and by the analyses of the transformed strains. Antibiotics resistance assays showed that the dicistronic expression cassette conferred high spectinomycin resistance to both the E. coli cells and the Synechococcus cells. PCR analysis and Western-blot analysis were carried out to confirm the integration and expression of the NTF1 gene, respectively. Through simple molecular manipulations, the artificial polycistronic structure described here can be conveniently used to express other favorable genes or operons in cyanobacteria, and to study the cyanobacterial gene expression as well.     

拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建

文章提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR扩增出HIS1-3基因的cDNA片段,连接到pEASY-T1Simple载体上,转化到Trans1-T1感受态细胞内,筛选阳性单克隆并抽提质粒。利用限制性内切酶Eco91Ⅰ和NcoⅠ对质粒pEASY-T1-HIS1-3和植物表达载体pCAMBIA2301进行完全双酶切,通过电转化法,将重组表达载体pCAMBIA2301-HIS1-3导入根癌农杆菌C58中以期获得携带HIS1-3基因的根瘤农杆菌株,为研究HIS1-3基因的抗逆分子机理以及遗传改良作物抗逆性奠定了基础。     

菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体构建及原核表达

分析菠菜叶绿体基因组全序列,选用了rbcL基因和accD基因的间隔区作为外源基因的定点整合位点,并从菠菜叶绿体基因组中克隆了rbcL基因全长和accD基因的5′端部分,长度分别为1956 bp和1320 bp。以这2个DNA片段作为同源重组片段,以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3′控制外源基因的转录,构建了包含筛选标记基因aadA基因(编码氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶,具有壮观霉素和链霉素抗性)和报告基因GFP(编码绿色荧光蛋白)的菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGA。酶切结果显示构建正确。将该载体转化大肠杆菌,在激光扫描共聚焦显微镜下用488 nm蓝光激发,发现大肠杆菌发出强烈的绿色荧光,而对照菌体没有荧光,表明GFP基因在原核大肠杆菌中已经成功表达。实验结果说明构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体pRAGA可以用于菠菜叶绿体转化。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.