动态固定化方法制备微酶反应器研究初探

以固定化人工膜为固定相,胰蛋白酶为固定靶蛋白,利用生物功能化色谱的方法,制备固定化微酶反应器,并与HPLC-MS/MS技术联用,检测目标蛋白牛血清白蛋白、肌红蛋白和细胞色素C的酶解效率.实验初步证明,所制备的新型微柱酶解器具有活性高、稳定性高、催化效率高、酶活性持久、快速再生及操作简单等优点.     

超声波辅助Urea-Free试剂结合热变性快速酶解蛋白质

建立了一个超声功率-超声时间的安全区域,在此范围内进行超声波辅助酶解时,能避免超声波随机断裂蛋白质;在此安全区域内采用响应面法获得最佳超声功率和超声时间.建立了超声波辅助Urea-Free试剂结合热变性快速酶解蛋白质的方法,将蛋白质依次进行10 min超声波浴辅助Urea-Free还原烷基化反应、90 ℃热变性15 min, 超声波辅助胰蛋白酶酶解15 s.应用此快速酶解方法鉴定3种典型标准蛋白质(牛血清白蛋白、细胞色素C和肌红蛋白),在25 min内达到与传统整夜酶解方法相同的鉴定结果,并获得更高的序列覆盖率.     

固定化胰蛋白酶整体小柱的制备及其用于微量蛋白质的快速酶解

发展了一种光引发聚合法制备固定化胰蛋白酶整体小柱的方法,以用于微量蛋白质的快速酶解。整体小柱由功能单体4-戊烯酸琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸羟乙酯,交联剂季戊四醇三丙烯酸酯和三元致孔剂二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、十二醇在20 μL的移液器吸头尖端原位聚合而成。形成整体柱后,胰蛋白酶分子通过氨基与琥珀酰亚胺酯反应实现固定化。系统研究了聚合溶液中活性酯含量与柱床体积对胰蛋白酶固载量的影响,评价了固定化酶整体小柱对标准蛋白细胞色素C和牛血清白蛋白的酶解效率,以及整体小柱的稳定性和重复性。结果表明,在离心辅助下,酶解过程可在10 min内完成,批次间具有良好的重复性。最后将固定化酶整体小柱应用于1×10⁵个人急性早幼粒白血病（NB4）细胞与人急性T细胞白血病（Jurkat T）细胞的快速酶解,经纳升级液相色谱与高分辨质谱联用分析后鉴定得到2489个和2572个蛋白质。相比于溶液状态下的酶解,分别提高了2.2%和6.1%的蛋白鉴定数量,展现了其在蛋白组学研究中的应用潜力。     

全二维微柱液相色谱-质谱鉴定人胃癌组织中的差异蛋白质

构建了以阳离子交换色谱-反相色谱(SCX-RPLC)为分离模式的新型全二维微柱液相色谱-质谱分离平台.采用了醋酸铵缓冲液梯度洗脱,实现了第一维肽段的分步洗脱,洗脱的肽段经富集除盐后通过接口进入反相色谱微柱,通过线性梯度实现第二维进一步分离,最后进入质谱进行检测.采用此平台分析了人胃癌组织与正常组织提取蛋白质信息,其中正常胃组织鉴定蛋白质数为537个,而癌症组织鉴定蛋白质数目为506个.对胃癌和正常组织两种提取蛋白质酶解产物的蛋白质检索结果进行比较分析,将鉴定的蛋白质按照物理性质进行分布,找出正常组织与癌症组织间蛋白质差异,筛选出一种可能发生变异的癌症特有蛋白.     

基于核酸适配体的微流控芯片酶反应器用于蛋白质的分析

将核酸适配体作为胰蛋白酶固定化介质,制备了一种新型的微流控芯片酶反应器,并与高效液相色谱-串联质谱联用,搭建了在线分析平台;分别使用标准蛋白及混合蛋白样品对芯片的酶解效率及联用平台的分析能力进行了初步评价。结果表明,5 ng肌红蛋白经该平台分析后肽段覆盖率可达到37%;对500 ng混合蛋白进行3次平行分析,肽段覆盖率及相对标准偏差分别为44.3%、6.5%(牛血清白蛋白), 65.0%、2.7%(肌红蛋白)和62.0%、5.6%(细胞色素c);初步实验表明,该在线分析平台具有检测灵敏度高、重现性好、酶解效率高的特点,有望在蛋白质组学分析中发挥重要作用。     

整体固定化酶反应器的研制

制作了微型整体柱型的固定化酶反应器。在500μm内径毛细管内,以乙烯基三甲氧基硅烷处理形成端基烯键,采用原位合成法,以甲基丙烯酸2-羟乙酯为功能单体,以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂制备了整体柱。整体柱表面的羟基经NaIO4氧化形成醛基后与胰蛋白酶的氨基进一步反应,实现胰蛋白酶的固定。在24s内,该酶反应器实现了肌红蛋白和细胞色素c的酶解,经MALDI-TOF MS鉴定,序列覆盖率分别达到65%和79%。     

原子转移自由基聚合修饰银丝固定化酶反应器的制备及在蛋白质组鉴定中的应用

针对传统溶液酶解存在的酶解时间较长、酶自切物干扰以及蛋白酶不能重复使用等缺陷,通过电子转移生成催化剂的原子转移自由基聚合法修饰银丝,并以其为载体制备了一种新型的固定化酶反应器。用质谱考察了银丝固定化酶反应器(SW-Trypsin)的酶解效率、重复性和回收率。结果表明:绒毛状聚合物修饰的SW-Trypsin的酶解效率较高,酶解标准蛋白牛血清白蛋白(BSA)20 min后,肽段的氨基酸序列覆盖率可达93%,高于传统溶液酶解方法酶解16 h所得79%的覆盖率。使用该固定化酶反应器于一个月内8次酶解BSA所得的氨基酸序列覆盖率在89%到97%之间,平均覆盖率为94%,显示出良好的稳定性。另外,该固定化酶反应器酶解马心肌红蛋白(MYO)的回收率为87.67%。最后,用SW-Trypsin酶解腾冲嗜热菌全蛋白20 min,所鉴定到的氨基酸序列覆盖率和蛋白数量与同样条件下溶液酶解16 h的结果接近,且零漏切位点肽段的比例更高。加之容易分离的优点,SW-Trypsin在蛋白质组学的应用中具有良好的前景。     

多层开管毛细管酶反应器的制备及在蛋白质酶切中的应用

以石英毛细管作为酶固定化的载体, 在毛细管内壁上逐步合成树枝形大分子聚酰胺-胺(PAMAM), 再通过交联剂戊二醛将胰蛋白酶直接键合到该大分子的末端氨基上, 并对酶固定化条件进行了优化, 制备了多层酶反应器. 利用该酶反应器对马心细胞色素C等蛋白质进行了酶切, 并对酶切的条件进行了优化. 实验结果表明, 该固定化酶反应器具有较高的酶切效率、良好的重现性和稳定性, 可用于蛋白质组学的研究.     

一种改进的凝胶分离后蛋白质溶液酶解方法

报道了改进的凝胶电泳分离后蛋白质溶液酶解方法。将凝胶分离后的蛋白转移到PVDF膜上,直接用碳酸氢铵中和从膜上的蛋白洗脱溶液至弱碱性,并在此溶液中直接进行蛋白酶解。方法避免了胶内杂质对质谱鉴定蛋白质的干扰。用标准蛋白进行了验证,并在此基础上鉴定了中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞系中的16个蛋白点。与已报道的方法比较,本方法蛋白回收率提高到90％左右;与传统的胶内酶解方法比较,本方法具操作简单,实验流程较短;涉及的试剂较胶内酶解少,因此带来的杂质影响小;在蛋白转印以后还可与许多其它实验方法相结合,比如免疫印迹等优点。     

互补多酶解法在蛋白质C末端质谱检测中的应用

建立了互补型多酶解法与串联质谱联用鉴定蛋白C末端技术.在大量蛋白的实际检测中,根据蛋白序列分别采用溴化氰、胰蛋白酶、谷氨酸内切酶和糜蛋白酶进行酶解或混合酶解.利用此技术对8个蛋白不同长度的C末端肽段(分子量分布在200～3000 Da之间,目的肽段分别为m/z 272.20,788.45,796.48,944.58,1...