人源性抗HBc单链噬菌体抗体库的构建

利用RT－PCR和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体（抗HBc）阳性患淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体（ScFv）基因，重组于噬菌粒载体pHEN1，转化抑制型大肠杆菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。库容量达106。     

抗弓形虫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

采用弓形虫可溶性抗原攻击的小鼠,取小鼠脾脏从中提取细胞总RNA,通过RT-PCR扩增鼠源抗体VH和VL基因,并采用重叠PCR (SOE-PCR)方法构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载体pCANTAB5E中,转化于感受态大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.从20个噬菌体克隆中筛选到15个具...     

小鼠噬菌体抗体库的构建和N-肽结合单链抗体的筛选

成功构建一库容量为1.7×10⁸的小鼠噬菌体抗体库,并从中淘选出对N-肽有结合活性的单链抗体。首先从未免疫小鼠的脾脏中提取总RNA,分离出mRNA,经逆转录合成其总cDNA。随后通过PCR分别扩增出抗体重链和轻链可变区V_H、V_L的基因片断,再经重组PCR将两片断由一编码(Gly₄Ser)₃十五肽的接头连在一起,并克隆到噬菌质粒pCANTAB 5E中,电击转化大肠杆菌TG1。经辅助噬菌体M13KO7超感染回收全部重组噬菌体,此即噬菌体抗体库。N-肽是一种新发现的神经肽,其N端与阿片肽高度同源,可与阿片肽受体相互作用。对其研究可能有助于了解成瘾机制和有临床应用价值。将生物素化的N-肽与抗体库相互作用,用偶联有链霉亲和素的磁珠富集与N-肽结合的重组噬菌体,经四轮淘选,得到亲和力较高的单链抗体。     

噬菌体抗体库的构建

噬菌体抗体库技术是近年来非常活跃的一个研究领域．本文主要讨论噬菌体抗体库构建中一些关键的问题．     

噬菌体抗体库的构建

噬菌体抗体库技术是近年来非常活跃的一个研究领域,本文主要讨论噬菌体抗体库构建中一些关键的问题。     

抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

EL-4荷瘤鼠单链噬菌体抗体库的构建

目的:构建一个EL-4荷瘤鼠的单链噬菌体抗体库,为筛选高特异性和高亲和力的单链抗体做准备.方法:于C57小鼠腋区接种EL-4细胞,待肿瘤长大后,从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR技术扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因(VH、VL),用Linker奖VH和VL基因连成单链抗体可变区片段(scFv).双酶切后(Not Ⅰ、Sfi Ⅰ)与预备好的pCANTAB5E噬粒载体连接,转化入感受态TG1,构建EL-4荷瘤鼠的单链噬茵体抗体库.随机抽取转化后的20个克隆,用以检测外源DNA的转入情况.结果:PCR扩增出的VH约有340bp和VL约有320bp,scFv的长度约有750bp.转化后的TG1约有1.67×107个茵落,随机挑取20个克隆,双酶切显示五分之一的茵落转化了外源DNA片段,有效库容为3.34×106.结论:成功构建了EL-4荷瘤鼠的单链噬茵体抗体库.     

噬菌体单链抗体导向溶栓剂的构建

Fibrin\|specific antibodies were isolated from a phage\|displayed single\|chain antibody(ScAb) library using affinity selection or panning.DNA shuffling was introduced to realign the specific antibody genes in order to mimic the antibody maturation in vivo. After cloning of shuffling products,a secondary library was constructed,from which the specific antibody against fibrin with higher activity was selected through panning and screening.The fibrin\|specific antibody gene and uPA functional domain gene fragment were joined together,then inserted into expression plasmid pET\|21a.The ScAb/uPA fusion protein was expressed with the induction of IPTG.In substrate S 2444 assay,the uPA activity of the chimera was about 3.1×10 3?IU/mg periplasmic protein of host E.coli .It also kept up the affinity to fibrin.     

噬菌体显示抗乳腺癌单链抗体的基因克隆和筛选

克隆和连接乳腺癌杂交瘤单克隆抗体的轻、重链可变区基因，构建该单链抗体的噬菌体显示系统，经严格的相关肿瘤细胞株的固相细胞正负筛选和多步液相结合-洗脱细胞筛选，得到特异性高、亲和力强的单链抗体基因，用于进一步构建重组免疫毒素，为临床乳腺癌和生物靶向治疗奠定基础.     

多药耐药性肿瘤细胞相关噬菌体抗体库的构建

利用噬菌体抗体库技术 ,构建了多药耐药性肿瘤细胞相关噬菌体抗体库。以多药耐药性肿瘤细胞 KB- A1为免疫原免疫 Bal B/c小鼠 ,从其脾脏提取总 RNA,并分离出 m RNA。RT- PCR扩增出 VH 和 VL 基因 ,经重叠延伸反应组装成单链抗体 ( Sc Fv)。将其克隆入噬菌粒载体p CANTAB 5 E中 ,电转化 E. coli TG1 ,成功构建了库容为 0 .8× 1 0 6的噬菌体抗体库 ,为获得多药耐药性相关分子及肿瘤细胞特异的噬菌体抗体奠定了基础     

ICAM-1特异结合肽的淘选与性质研究

利用噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了随机十五肽库,根据转化率计算库容量为1.36×108.用PCR-SSCP检验了库的异质性.以固相包被亲和淘选的方法,经过4轮淘选和ELISA分析,得到了5个可与重组人细胞间粘附分子1(ICAM-1)特异结合的噬菌体克隆,对所展示的十五肽进行了序列分析.其中活性较高的噬菌体展示十五肽与ICAM-1的亲和常数约为7.87 ×107.     

Construction of Large Human Single—chain Antibody Phage Display Library

A large human naive single chain antibody (scFv) library is constructed from 60 healthy donors via phage display technique.During the period,some methods are employed to optimize the diversity,such as multi donors,different annealing temperature,half-nest PCR.and assembly by two-way fusion PCR.In this study,78 electroporations resulted in 1010 library,diversity of which is assayed by enzyme fingerprint.The efficiency and diversity are all better than other researches.     

从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质配基

为了研究噬菌体展示技术的应用，以溶菌酶为靶分子从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质的高亲和力噬菌体配体，所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达0．634．通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列，认为基元HWWW是肽段与酶分子发生亲和的必需序列．此外，由于靶分子和高亲和性展示肽的等电点分别为11．2和6．74，因此在亲和环境中携带异种电荷，利于亲和吸附的发生，而此时低亲和性展示肽与靶分子携带同种电荷，阻碍了亲和吸附．同时，高亲和性肽段HWWPAS和与其有较高同源性的肽段HWTWWNL都有适中的疏水性，这有利于肽与靶分子表面的疏水位点相互作用从而产生亲和吸附．     

一种大量制备鼠源性多克隆抗体的方法

 用人绒毛膜促性腺激素或人免疫球蛋白作为抗原,经小剂量、多次免疫Balb/c鼠,并于其腹腔内注射NS-1骨髓瘤细胞,制备了大量高效价的鼠源性多克隆抗体腹水.该实验为快速制备大量鼠源性多克隆抗体提供了一种新的方法.     

植物血球凝集素-Sepharose 4B亲和层析纯化人绒毛膜促性腺激素

本文报道一种新的制备和纯化HCG的方法．人工流产物经45％乙醇抽提、调pH5．2～5．4后40～60％乙醇分级、植物血球凝集素-Sepharose4B柱层析纯化后,低温酒精沉淀干燥,可得到比效价3777.8IU／mg的hCG精品．     

从噬菌体展示七肽肽库筛选α-淀粉酶特异性配体

为了建立蛋白质亲和配基的高效筛选方法，以淀粉酶为靶分子，利用交替洗脱法从七肽噬茵体展示库中筛选具有高亲和力的噬茵体配体．结果表明，交替洗脱法筛选出的特异性配体的回收率和ELISA信号值均优于酸洗脱法；采用交替洗脱法能够更加有效和迅速地筛选到淀粉酶的高亲和力配体．分析筛选得到的不同噬茵体克隆DNA插入片断的氨基酸序列，发现了可能与配体高亲和性有关的氨基酸残基．     

三种脑-肠肽对人绒毛膜促性腺激素分泌的影响

本工作利用灌流技术观察了3种脑-肠肽(P物质,CCK及NT)对新鲜人工流产的绒毛hCG分泌的影响。结果表明,P物质,CCK及NT均明显刺激绒毛释放hCG,并发现CCK作用大于P物质及NT。提示,hCG的分泌可能受这3种脑-肠肽的调节。