毛细管电泳与MFOLD软件研究单链脱氧核糖核酸分离二级结构

从Gene Bank数据库中下载质粒基因序列,用DNAssist软件分析并最终建立了单点碱基突变模型,并以此为研究对象对单链DNA分离机理进行研究探讨。采用高效毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)方法,以线性聚丙烯酸胺为筛分介质对模型进行分离分析,并与MFOLD软件所预测的单链二级结构进行对照分析。分离条件为:线性聚丙烯酸胺浓度为6%,负极进样,13kV分离,温度为19℃,λem=488nm、λex=520nm。结果发现毛细管电泳实际分析结果有4个单链峰,而MFOLD软件预测的只有3种二级结构,预测的准确度为75%,MFOLD软件虽然有局限性,但预测DNA二级结构仍有一定的参考价值。     

毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用

核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE-SELEX)的主要方法(ECEEM,NECEEM,Non-SELEX和三者比较)和研究进展进行了综述。     

毛细管区带电泳法考察牛凝血酶、核酸适配体与丹参活性分子间的相互作用

采用毛细管区带电泳法(CZE)研究牛凝血酶(B-Thr)、凝血酶核酸适配体(Apt29)与丹参中3种活性物质(丹参素钠(SAS)、原儿茶酸(PA)、阿魏酸(FA))间的相互作用。电泳条件为:毛细管长度40 cm,紫外检测波长214 nm,分离电压15 kV,压力进样3.45 kPa,进样时间5 s。分别固定3种活性药物分子的浓度,改变B-Thr或Apt29的浓度,采用Scatchard方程和非特异性结合方程计算结合常数(K_b),表征药物分子和B-Thr或Apt29的相互作用大小。结果表明,PA与B-Thr结合能力最强,K_b为3.39×104L/mol,FA与B-Thr的K_b为1.05×104L/mol,SAS与B-Thr未表现出结合能力;在与Apt29的相互作用的研究中显示,SAS基本未与Apt29结合,FA与Apt29结合能力强于PA与Apt29的结合能力,FA、PA与Apt29的K_b分别为1.48×104L/mol和1.32×104L/mol。该研究报道了丹参活性分子与B-Thr、Apt29的相互作用结果,可为核酸适配体(蛋白质)与中药分子相互作用的探索提供新方法,适配体与中药分子相互作用亦可为中药分子的靶点发现、靶向转运提供借鉴。     

适配体功能化多壁碳纳米管整体柱分离富集细胞色素c

本文结合核酸适配体的特异性吸附及碳纳米管比表面积大的特点,研制了核酸适配体功能化碳纳米管/聚合物复合整体柱(AMMC),并将其应用于细胞色素c(Cyt c)选择性分离。结果表明,AMMC具有良好的通透性和稳定性,可选择性富集Cyt c,富集量可达1.47 mg。结合顺序注射系统,AMMC成功用于猪心样品中Cyt c的选择性分离富集,在生物样品分析中具有良好的应用前景。     

毛细管电泳法表征离子液体与蛋白质的相互作用

基于毛细管区带电泳考察了不同离子液体的阳离子母核、烷基侧链碳原子数目和阴离子组成对牛血清白蛋白的影响,以及离子液体[C4mim]BF4与肌红蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白、牛凝血酶和转铁蛋白之间的相互作用。利用亲和毛细管电泳法比较了[C4mim]BF4与上述蛋白之间的相互作用,并计算得到结合常数Kb分别为1.24×107 L/mol,1.23×106 L/mol,5.75×104 L/mol和5.60×104 L/mol。结果表明,转铁蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、牛血清白蛋白与离子液体的相互作用依次减弱,存在1～2个数量级的差异。结合毛细管区带电泳和亲和毛细管电泳模式可实现离子液体与多种蛋白质相互作用的定性与定量表征。     

毛细管电泳检测神经细胞凋亡

建立了毛细管电泳检测凋亡细胞DNA片段的方法.以DNA相对分子质量标准品为溶质,考察了分离条件(电压、进样时间、温度、聚合物浓度)对分离的影响.在优化条件下,利用毛细管无胶筛分电泳对缺氧缺血过程中不同时间点神经PC12细胞DNA片段进行了分析,并与流式细胞仪结果比较,研究缺氧缺血时胶质细胞凋亡过程.     

亲和毛细管电泳的研究与应用

近年来,由于毛细管电泳技术理论的不断完善,亲和毛细管电泳技术得到迅速发展,并在生命科学、生物技术、临床医学、药物学等领域具有广泛的应用.对亲和毛细管电泳的原理、优点及分类做了简要介绍,并且着重介绍了近几年ACE技术在蛋白质分析、核苷酸分析、药物分析、手性分离及小分子、离子分析等方面的研究进展,及其在亲和常数测定、蛋白质结构分析、核苷酸的检测中的应用.     

毛细管电泳与核酸适配体高效筛选

指数富集配体系统进化(SELEX)技术是核酸适配体筛选的通用技术,精准高效的筛选方法和筛选策略设计是成功筛选适配体的关键。本文概述了本课题组自2007年以来,应用毛细管电泳(CE)技术研究核酸适配体高效筛选的有关工作,包括CE在核酸适配体筛选前、筛选中及筛选后各环节中的分析分离应用、不同蛋白靶的分类及筛选策略、多种CE筛选模式和多尺度靶标的核酸适配体筛选。同时,探讨了SELEX中存在的问题,并对其发展前景进行了展望。     

细胞色素c与NO相互作用的光谱研究

目的:为了探究NO与细胞色素c(Cyt c)的结合反应过程以及其对血红素蛋白构象的影响。方法:本文采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色等光谱法研究不同价态Cyt c、不同影响因素下,Cyt c直接与NO之间的结合反应,并且阐述了NO与Cyt c反应的荧光猝灭机制。结果表明:NO更容易与三价铁Cyt c(Cyt c-Fe(III))反应。NO不仅能与蛋白质氨基酸侧链弱结合,还能与血红素铁发生紧密结合。通过荧光猝灭机制可知:NO与Cyt c结合为静态猝灭,二者以静电引力等弱结合力结合,结合位点数为1。同时,受NO诱导作用,Cyt c中血红素Fe-S键变弱促进NO与Cyt c的紧密结合。二者结合受到NO浓度的影响。溶液中游离芳香族氨基酸均促进两者结合反应,其中Tyr促进作用最强;355 nm激光照射促进NO与Cyt c的结合;但有Phe、Trp残基存在时激光照射却阻碍了结合作用。NO与Cyt c的结合会改变Cyt c蛋白构象及周围氨基酸残基的微环境,导致肽链伸展,极性增强。意义:本文结果对于进一步研究NO气体小分子与血红素蛋白结合以及在不同因素条件下对血红素环境的影响有重要...     

酿酒酵母凋亡细胞的毛细管电泳行为研究

用醋酸诱导酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)作为细胞凋亡过程,用扫描电镜和流式细胞术两种检测技术确证其细胞凋亡特征：用800mmol／L乙酸诱导21h后的细胞在电镜图上出现明显表面皱缩、细胞壁内陷;流式细胞图上出现典型凋亡峰——亚二倍体峰。详细探讨其高效毛细管电泳的行为,发现凋亡细胞在300nm处的强吸收峰消失;凋亡细胞核在220nm处,12～18min之间出现了一个新的分离峰。研究表明,毛细管电泳非常适于对细胞凋亡过程进行动态特征监测。     

微流控芯片毛细管电泳在蛋白质分离分析中的应用研究进展

重点介绍了近年来国内外在微流控芯片毛细管电泳法用于蛋白质分离分析方面的研究进展。按照分离模式的不同,综述了各种应用于蛋白质分离的微流控芯片毛细管电泳系统,讨论了抑制芯片中的蛋白吸附的各种方法,并展望了芯片毛细管电泳系统在蛋白质分离领域的发展前景。引用文献47篇。     

毛细管电泳技术在重大疾病特异性蛋白质分析中的应用

人类重大疾病特异性蛋白质的识别、鉴定等是目前生命科学亟待解决的问题。毛细管电泳技术用于蛋白质分析,具有装置简单、分析速度快、试剂和样品消耗少以及有多种分离模式和检测手段等特点。本文综述了毛细管电泳技术在人类重大疾病特异性蛋白质分析中的应用,包括肿瘤疾病、神经退行性疾病和输血性传染病等的特异性蛋白质检测。     

毛细管电泳应用于测定牛血清白蛋白与脂质体的相互作用

建立了一种用毛细管电泳法检测牛血清白蛋白(BSA)与脂质体相互作用的分析方法。氧化指数的测定实验结果表明经过冷冻干燥的脂质体稳定性更好;毛细管电泳表征脂质体的电荷性质实验结果表明脂质体在pH 5.0～8.0的条件下呈电中性。在pH 7.0的条件下,以各种浓度的脂质体混悬液为电泳缓冲液,以0.8%二甲亚砜(DMSO)为内标,随着缓冲液中脂质体质量浓度从0增加到2.4 mg/mL,BSA的有效淌度从-2.232×10-4 cm2·V－1·s－1变化到-3.046×10-4 cm2·V－1·s－1;结合Scatchard分析,测得BSA与脂质体的结合常数为2.522×103(g/mL)－1。该方法简单、快速,为研究蛋白质与脂质体的相互作用提供了新的技术手段。     

毛细管电泳法考察全氟辛酸与人血清白蛋白的相互作用

利用毛细管电泳（CE）技术建立了全氟辛酸（PFOA,C₈HF₁₅O₂）与人血清白蛋白（HSA）相互作用的分析方法。在生理条件下构建配体（PFOA）-受体（HSA）相互作用模型,通过淌度移动法、区段-区段动力学（plug-plug kinetic,PPK）法、简化的Hummel-Dreyer（HD）法研究其与HSA的相互作用。简化的HD法运用非线性方程、Scatchard方程和Klotz方程获得PFOA-HSA体系的相互作用参数,进而分析了模型适用度。结果表明,淌度移动法、PPK法、简化的HD法均适用于PFOA-HSA体系相互作用的分析,其中简化的HD法最优。模型适用度分析得出非线性回归方程为最适理论模型。相互作用参数测试表明PFOA-HSA相互作用体系之间发生的结合反应只有单一类型的结合位点且结合稳定。相关工作阐明了人血清白蛋白与PFOA的相互作用机制,可为PFOA毒理机制的深入研究提供有益参考。     

两种表征核酸适配体-靶蛋白亲和作用的毛细管电泳方法比较

适配体-靶分子间的亲和作用表征是理解和应用核酸适配体发挥特异亲和作用的基本前提,CE技术则为上述表征提供了多模式的简捷途径,但多种模式体系间的结果往往存在差异,导致CE亲和评价可靠性和进一步应用受到限制,亟须建立多CE方法测定适配体-靶分子间亲和作用的系统比较研究。该研究以凝血酶及其特异性作用于肝素结合位点的适配体29mer为模型体系,基于CE-激光诱导荧光检测,引入CE-迎头分析(FA)评价方法,并比较其与预平衡-毛细管区带电泳(PE-CZE)的异同。首先进行了CE-FA方法分离条件的优化,37℃、0.5 h孵育完全后进样,进样时间为30 s,在较低工作温度(15℃)、较短毛细管长度(30 cm)及生物相容性好的缓冲体系2×TG(Tris-甘氨酸缓冲液,pH 8.5)条件下,经15 kV分离时,得到了稳定的荧光标记29mer(F29mer)-凝血酶复合物及游离F29mer平台峰。加入1 g/L牛血清白蛋白(BSA),有效提高了CE-FA平台峰高及迁移时间的重复性。详细讨论了两种方法下6种拟合方式的结果及特点。针对CE-FA和PE-CZE法,以结合适配体/游离适配体的浓度比对游离适配体...     

动力学毛细管电泳法求解蛋白质与单链脱氧核糖核苷酸结合的解离常数及可靠性分析

平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)可用于测定复合物的解离常数(K_d)。该文以单链脱氧核糖核苷酸结合蛋白(SSB)和单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)相互作用为模型,分析了相互作用强弱的电泳图谱特征,测定了不同条件下复合物的K_d,建立了基于积分偏差的误差分析方法。结果表明,SSB与ssDNA相互作用强弱所致的电泳图差异、SSB与ssDNA的浓度比、毛细管分离温度均影响K_d的计算。此外,基于25℃时SSB与5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′(15mer)人凝血酶适配体作用模型的数值分析结果表明,在现有实验条件下,手动积分峰面积时产生的面积偏差对K_d计算结果有影响,但在10%的偏差区间内,所求K_d值的最大相对偏差小于7%,所求K_d值的误差可忽略。该文证实了基于NECEEM求解动力学相关参数的方法可靠。     

Capillary electrophoresis as a tool for screening aptamer with high affinity and high specificity to ricin

Aptamers which specifically recognize targets are selected from random oligonucleotide library using systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). In this paper, capillary electrophoresis (CE) as a separation approach has been introduced to SELEX procedure. The high efficiency of CE gives rise to greatly shorten the selection procedure. The results from enzyme-linked assay and dot blot experiment show that an enrichment pool has been obtained after four rounds selection, which can specifically recognize ricin. __________ Translated from Chemical Journal of Chinese Universities, 2006, 27(10): 1,840–1,843 [译自: 高等学校化学学报]     

Comparison between capillary electrophoresis and ion-chromatography for analysis of inorganic anions

Separation and detection of some selected inorganic anions with capillary electrophoresis are shown. The anions are separated in microbore capillaries (25 m* 0.2 m) and detected with a UV-detector. Results are compared with the method of ion exchange chromatography. In consideration of the most important physical and chemical parameters an easy kind of computer simulation for such electropherograms was developed.To get optimal results of separation and UV-detection in capillary electrophoresis some parameters of the device HPE 100, i.e. loading time in the electrokinetic sample injection mode and the running voltage are varied. The behaviour of absorption in the UV region of the chosen anions as well as the influence of pH values in retention behaviour are investigated. There is a simple way to calculate the electrophoretic mobilities from known retention times. Approximate limits of detection for all anions and for each technique are given.     

毛细管电泳法表征多肽及糖蛋白的稳定性

建立了毛细管电泳表征多肽和糖蛋白稳定性的方法。分别以血管紧张素II(Ang II)和植物血球凝集素(PHA)、牛凝血酶(B-Thr)、人凝血酶(H-Thr)、辣根过氧化物酶(HRP)4种糖蛋白为多肽和糖蛋白的模式分子。从样品浓度、电泳缓冲液、样品溶液pH和离子强度等方面优化了血管紧张素II的分离分析条件;从毛细管的选择、样品的电荷状态、电泳缓冲液的选择和分离电压的影响等方面讨论了糖蛋白的分离条件。Ang II和4种糖蛋白的稳定性试验结果表明:Ang II可在pH 7.4的硼酸盐缓冲液(0.02 mol/L)中于4℃下稳定放置48 h; 4种糖蛋白可在pH 7.4硼酸盐缓冲液(0.2 mol/L)中于20,4,-20℃下稳定放置48 h;放置时间大于一周且小于四周时,在-20℃下各蛋白质均保持稳定;放置时间大于两周且小于四周时,只有HRP在上述3个温度下均保持稳定。该方法具有高效、快速、简单、低成本的特点,可广泛应用于多肽和蛋白质的稳定性表征。     

毛细管电泳法测定阿霉素脂质体药物中的微量硫酸根离子

建立了以硝酸钾作为背景电解质测定阿霉素脂质体药物中微量硫酸根离子的毛细管电泳分析法。考察了分离电压、背景电解质、电渗流改性剂浓度、pH值对分离测定的影响。结果表明,当毛细管长度为60 cm(有效长度51.5 cm)、分离电压为~15 kV、缓冲溶液采用20 mmol/L硝酸钾(pH 7.0)、电渗流改性剂采用0.4 mmol/L十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、检测波长为202 nm时,阿霉素脂质体破乳液中硫酸根离子和氯离子在3 min内得到了基线分离,硫酸根离子迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别小于0.01%和1.0%,检出限为5 μg/L。用该方法对阿霉素脂质体样品中的微量硫酸根离子进行了分析测定,结果令人满意。