核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A

建立了核酸适配体识别-荧光探针技术检测赭曲霉素A(OTA)的新方法.基于微孔板上固定的核酸适配子与目标物质OTA结合时构象发生变化,导致预先与其互补杂交的FAM标记短链DNA解离,引起荧光信号发生变化,据此可实现对OTA的定量检测.当微孔板包被亲和素浓度为25 mg/L、适配子浓度为50 nmol/L,FAM标记互补短...     

基于发夹结构DNA铜纳米簇的链霉素快速检测

建立了基于铜纳米簇(CuNCs)的免标记荧光生物传感器快速检测链霉素的方法。利用链霉素核酸适配体和双链茎设计并合成了发夹结构DNA(hpDNA)模板,富含AT的双链茎部分可以合成CuNCs。在CuNCs荧光传感体系中加入链霉素后,链霉素与核酸适配体结合,使hpDNA双链茎打开,CuNCs荧光强度明显下降。在优化条件下,该方法检测链霉素的线性范围为0.1～20 mg/L,线性回归方程为y=240.17-10.31x,线性回归系数r²为0.9954,检出限为4.36μg/L。该方法对牛奶样品的加标回收率为98.6%～104.8%。方法无需复杂的DNA序列设计、荧光标记,实验操作简单易行,适用于链霉素的快速检测。     

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50～100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。     

基于无标记的核酸适配体荧光生物传感器检测凝血酶

设计了一个简单、通用、基于核酸适配体无标记的高敏感、高专一检测凝血酶的荧光方法。以无标记凝血酶核酸适配体单链DNA为识别元素,Pico Green染料传导互补双链的荧光信号。Pico Green是一种不对称菁,当其单独存在时不产生荧光信号,而当其被吸附到互补的双链DNA上时,可产生很强的荧光信号,但被吸附到单链DNA上时,却无明显的信号改变。基于该性质,将其用于凝血酶的检测。该方法对凝血酶的响应线性范围为1.0×10~(-14)~1.0×10~(-7)mol/L,相关系数(r~2)为0.99,检出限为1.0×10~(-14)mol/L。1.0×10~(-8)mol/L两种干扰物质(牛血清蛋白和细胞色素C)的存在不影响凝血酶的检测,表明该方法对凝血酶具有非常好的专一性。该方法成功应用于对人血清样品的检测,其平均回收率为97%~102%。方法可简单、灵敏、特异性地检测凝血酶,有望用于医学临床诊断等领域。     

细菌的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选的能够以高亲和力和高特异性识别靶标分子或细胞的核糖核酸(RNA)和单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。作为化学抗体,核酸适配体的制备和合成比抗体的成本更低。核酸适配体的靶标范围极其广泛,包括小分子、生物大分子、细菌和细胞等。针对细菌靶标筛选的适配体,目前主要应用于食品、医药和环境中的细菌检测。细菌的核酸适配体筛选可以通过离心法将菌体-适配体复合物与游离的适配体分离,并通过荧光成像、荧光光谱分析、流式细胞仪分选、DNA捕获元件、酶联适配体分析等方法表征适配体与靶标的相互作用。筛选出的适配体可结合生物、化学检测方法用于细菌检测。本文介绍了细菌适配体的筛选和表征方法以及基于适配体的检测方法的最新进展,分析了不同检测方法的利弊,并列出了2011~2015年筛选的细菌的核酸适配体。     

基于末端脱氧核苷酸转移酶扩增DNA-铜纳米簇荧光传感检测L-组氨酸

利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)扩增形成聚胸腺嘧啶(T)DNA模板,制备了聚T铜纳米簇(TS-CuNCs),构建了一种用于L-组氨酸(L-His)检测的荧光传感分析新方法.TdT酶在dTTP存在下合成聚T单链DNA核苷酸序列.由于胸腺嘧啶和Cu2+之间的亲合力,聚T单链DNA作为合成铜纳米簇(CuNCs)的模板,加入还原剂后形成CuNCs,荧光强度增强.在L-His存在下,L-组氨酸的咪唑基与Cu2+螯合形成L-His-Cu2+配合物,因而进入聚胸腺嘧啶序列中的Cu2+量减少,使得合成的CuNCs数量减少,导致荧光信号减弱.实验结果表明,体系荧光响应信号与L-His浓度的对数值在5.0×10-9~5.0×10-4 mol/L范围内呈线性关系,检出限达到3.4×10-9 mol/L.本方法用于实际尿液样品中L-组氨酸检测的回收率为97.4%~104.6%,在生物医学及临床诊断中具有潜在应用价值.     

基于DNA双链取代策略免标记检测铅离子的研究

建立了一种基于DNA双链取代策略和SYBR GreenⅠ(SG)作为荧光染料插入剂进行免标记铅离子检测的荧光传感方法。SG作为一种染料分子,与单链DNA作用产生的荧光强度很弱,但可以插入双链DNA,使SG荧光强度明显增强。检测时铅离子适配体首先与其部分互补单链DNA杂交形成稳定的双链DNA结构,当溶液中存在铅离子时,铅离子与其适配体特异性结合,双链DNA的数量减少,加入SG可实现铅离子的免标记定量检测。此方法具有灵敏度高、特异性强、简便快速等优点。最低检测浓度为2 nmol/L,检出限(S/N=3)为1.6 nmol/L,实际样品检测结果良好。     

核酸适配体荧光探针在生化分析和生物成像中的研究进展

核酸适配体是指通过体外筛选技术从核酸文库中筛选出来,能够高特异性、高亲和力识别靶标物的寡核苷酸序列,具有靶标类型广泛、合成简单、相对分子质量小、化学稳定性高、易于进行生物化学修饰等优点。 核酸适配体能够通过折叠成特定的二维或三维构型与靶标物特异性结合,加上合适的信号转导机制,为重要靶标物的研究提供理想的分子识别与分子检测探针。 荧光检测技术具有高灵敏、高分辨率、易于实现多元分析等优点。 将核酸适配体的分子识别特性与荧光优异的光学检测性能相结合,在生命科学研究领域有着广泛的应用空间。 本文主要综述了核酸适配体荧光探针常见的分子设计和信号响应方式,及其在细胞成像、亚细胞成像中的应用研究,并对核酸适配体探针目前面临的一些挑战进行了讨论,最后对其未来的发展方向进行了展望。     

基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的荧光法检测四环素

以核酸适配体作为识别单元、核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)作为信号放大元件以及氧化石墨烯(GO)作为信号开关的荧光传感器来检测四环素(TC)。当体系中没有TC存在时,四环素适配体与其互补链(c DNA)杂交形成双链,EXO Ⅲ不能切割5'端标记有荧光基团的单链信号链(SP),加入GO后,信号链被吸附至GO表面并发生荧光淬灭。当体系中有TC存在时,核酸适配体能够识别并且结合TC,促使c DNA与SP链形成双链,这将诱导EXO Ⅲ从信号链3'端对c DNA-SP双链进行切割,释放出荧光基团,游离的荧光基团不能被GO吸附而淬灭,通过连续的酶促切割,得到更多的游离荧光基团,从而使得荧光信号明显增强。建立的荧光法对TC具有较高选择性,检测限(LOD)为671 pmol/L,方法已用于自来水样品中TC的测定。     

基于核酸适配体的荧光法检测水胺硫磷和丙溴磷

建立了基于适配体的农药水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法.采用可特异性识别水胺硫磷和丙溴磷、且5 '端标记荧光基团FAM的核酸适配体(F-ssDNA),与3 '末端标记猝灭基团DABCYL的短链序列(Q-ssDNA)互补杂交形成双链结构,荧光基团的荧光被淬灭,荧光信号很弱;此时加入靶分子,特异性结合核酸适配体,引起互补短链序列从双链结构中解离,使适配体荧光信号增强,基于此可实现水胺硫磷、丙溴磷的定量检测.优化后的检测条件为:将终浓度为25 nmol/L F-ssDNA与50 nmol/L Q-ssDNA在25℃孵育20 min,使二者杂交形成双链适配体探针复合物,加入等体积的农药样品孵育60 min,然后检测体系的荧光信号变化值△I.在最佳条件下,△I与水胺硫磷和丙溴磷的浓度均在50～ 500 μmol/L范围内呈线性关系.水胺硫磷的检出限(LOD,3σ)为11.4 μmol/L,相对标准偏差(RSD)为5.8％(n=10);丙溴磷的检出限为14.0 μmol/L,RSD为4.9％(n=l0).用于实际水样中两种农药的检测,加标回收率为85.8％ ～95.3％.     

基于纳米金探针和基因芯片的DNA检测新方法

运用荧光纳米金探针和基因芯片杂交建立一种新的DNA检测方法. 荧光纳米金探针表面标记有两种DNA探针: 一种为带有Cy5荧光分子的信号探针BP1, 起信号放大作用; 另一种为与靶DNA一部分互补的检测探针P532, 两种探针比例为5∶1. 当靶DNA存在时, 芯片上捕捉探针(与靶DNA的另一部分互补)通过碱基互补配对结合靶DNA, 将靶DNA固定于芯片上; 荧光纳米金探针通过检测探针与靶DNA及芯片结合, 在芯片上形成“三明治”复合结构, 最后通过检测信号探针上荧光分子的信号强度来确定靶DNA的量. 新方法检测灵敏度高, 可以检测浓度为1 pmol/L的靶DNA, 操作简单, 检测时间短. 通过改进纳米金探针的标记和优化杂交条件, 可进一步提高核酸检测的灵敏度, 这将在核酸检测方面具有重要的应用价值.     

荧光核酸适配体功能化氧化石墨烯生物传感器用于快速检测氯霉素

开发了一种无标记和快速的检测方法基于氧化石墨烯（GO）和荧光功能性G-四聚体探针（FGP），可用于定量检测氯霉素（CAP）.FGP由氯霉素核酸适配体和富含G碱基的核酸序列组成.核酸适配体用于结合CAP，并且由富含G碱基的核酸序列在K⁺，Na⁺离子的作用下形成的G-四聚体，然后与硫磺素T（ThT）结合后用作信号分子.在没有CAP的情况下，FGP通过π-π堆积相互作用被吸附到GO的表面上，阻碍了G-四聚体的形成导致溶液中的荧光强度低.在加入CAP时，FGP的核酸适配体部分可识别并结合CAP以形成复合物，导致其从GO解吸.因此，游离的富含G的碱基序列可以形成G-四聚体结构并与ThT结合，导致溶液的荧光强度增加.我们观察到荧光强度增加与CAP浓度在2~20 nmol/L范围内呈线性关系，检测限为1.45 nmol/L.此外，该检测系统用于检测加标牛奶中的CAP，回收率在93.2%~103.3%之间.这些结果表明，开发的方法可用于有效检测实际样品中的CAP.     

基于核酸适配体的荧光法检测中药中赭曲霉素A

赭曲霉素A(OTA)是污染中药材的重要真菌毒素,严重影响中药材质量和用药安全.在小檗碱溶液中加入OTA和其核酸适配体后,处于随意卷曲状态的核酸适配体会被OTA诱导折叠成为G-四链体构象,使小檗碱的微环境发生改变,从而增强其荧光信号.基于此,本文以OTA核酸适配体为识别原件,小檗碱为荧光探针发展了一种无标记的荧光体系检测OTA.对主要影响因素,包括K+,Mg2,小檗碱和核酸适配体浓度进行了优化.在最佳实验条件下,小檗碱荧光信号变化值与OTA浓度在5～200 nmol/L范围内成正比,检出限5 nmol/L.该方法仅使用无标记的核酸适配体完成了OTA的检测,避免了对核酸适配体的繁琐设计和标记.方法 有较高的特异性,并成功应用于中药桔梗中OTA的检测,回收率在86.3％～105.6％之间.     

基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷

本文提出了一种基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷(ATP)的传感策略。磁性纳米粒子表面易于修饰,而且操作方便,具有很好的分离效果,能够提高生物传感的选择性。首先,利用生物素与链霉亲和素之间的亲和力作用,将生物素标记的ATP核酸适配体连接到链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子表面,加入与ATP核酸适配体互补的一段DNA进行杂交,通过磁性分离除去未杂交上的DNA,加入靶向ATP,ATP与其适配体特异性结合将适配体的互补链通过磁性分离出来,磁性分离出的信号DNA继续用于下一步的杂交链反应,将信号放大,最后利用氧化石墨烯(GO)对荧光的猝灭效应降低背景荧光,达到高灵敏度、高选择性检测靶向ATP。其中,ATP的最低检测浓度为0.1nmol/L。     

基于双核酸适配体的夹心试纸条法在多菌灵检测中的应用研究

建立了一种胶体金标记核酸适配体的试纸条用于多菌灵的快速检测。将核酸适配体CZ13与AuNPs结合作为信号探针，生物素标记的核酸适配体CZ12固定在链霉亲和素包被膜上作为捕获探针。优化了影响灵敏度的实验条件，如信号探针制备中使用的NaCl和适配体的浓度，检测线上链霉亲和素与生物素标记的核酸适配体的摩尔比等。在最佳实验条件下，多菌灵检测范围为0.5～40μg/mL,检测限为0.45μg/mL。该方法可用于实际样品检测，检测时间为15 min,与果蔬中常见农残不存在交叉反应，方法准确、可靠、使用简便，适合样品的现场快速检测。     

胃腺癌核酸适配体的筛选与特异性研究

核酸适配体可作为分子探针应用于胃腺癌的早期诊断和治疗,具有广泛应用前景。本实验利用Serum-SELEX（Ser-SELEX）技术筛选胃腺癌核酸适配体。通过对候选适配体二级结构分析,其二级结构多为茎环结构。圆二色谱分析显示,7条候选核酸适配体呈右手螺旋特征。通过荧光定量核酸扩增检测系统（q-PCR）检测了候选核酸适配体对胃腺癌靶标的亲和力,表明候选核酸适配体浓度梯度与Ct值均呈正相关,亲和力常数为纳摩尔级别。利用q-PCR法、量子点法验证了候选核酸适配体识别靶标的特异性,结果均显示Apt-101对靶标亲和力更高,特异性更强,Apt-101的平衡解离常数（K_d值）为6.444±1.128nmol/L,特异性检测阳性率大于70%。     

基于核酸适配体和纳米粒子的光学探针

核酸适配体(aptamer)是一类通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的单链DNA或RNA。核酸适配体借自身形成的空间结构与靶标分子特异性结合,具有靶分子广、亲和力高、特异性强、易改造修饰等特点,因而在生命科学、临床诊断、药物发现和环境科学等方面得以广泛应用。近年来,核酸适配体与纳米技术结合,并利用纳米材料在光学、磁学、电学、化学及生物学方面表现出的特殊性质,实现了对靶标分子高灵敏度、高选择性、简便快速的识别与检测。本文评述了基于核酸适配体-纳米粒子特性的光学探针在生物大分子、金属离子和有机小分子检测等领域的应用现状与发展趋势,主要包括比色法、荧光光谱法、表面增强拉曼光谱法等。     

基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法

利用茎环结构定位探针构建了一个基于双酶切反应的级联信号放大体系,并将其用于核酸的检测.在该体系中,茎环结构定位探针首先是内切酶Tth EndonucleaseⅣ的作用底物,被剪切后又作为定位探针介导切口酶Nt.Bst NBI对分子信标实施剪切,将这2步剪切反应结合起来可有效克服切口酶对于目标核酸中特定识别序列的依赖,同时进一步提高了检测灵敏度.实验结果表明,荧光信号与目标DNA浓度的对数值呈线性相关,响应范围为1 pmol/L～1 nmol/L,并且具有良好的识别单碱基变异的能力.此外,本方法序列设计简单,通用性强,仅改变定位探针的部分序列即可实现对不同目标DNA的检测.对掺杂于血清中的目标DNA的检测结果验证了本方法在实际样品检测中的应用潜力.     

靶标介导DNA自组装及催化电流放大的microRNA电化学检测研究

该研究报道了一种靶标介导的DNA自组装及催化信号放大免标记电化学传感器定量检测microRNA-21的分析方法。根据靶标序列,设计一条末端标记巯基且具有茎环结构的捕获探针以及两条与捕获探针和靶标部分互补的DNA单链,通过金-硫键作用将捕获探针固定在金电极表面。当靶标(microRNA-21)存在时,自组装形成一种H结构的DNA复合结构;利用核酸链中磷酸骨架静电吸附电解液中的钌氨离子([Ru(NH₃)₆]³⁺,RuHex)以及DNA电子传递作用产生电化学信号;当无靶标时,不能形成DNA复合结构,电化学信号较弱。进一步利用铁氰根离子([Fe(CN)₆]^3-)能够氧化电化学还原产物([Ru(NH₃)₆]²⁺),产生电化学-化学偶联,从而实现催化电流信号放大。采用电化学阻抗谱确证DNA复合结构的形成,采用计时电量法考察捕获探针密度对电化学信号的影响,并优化探针浓度、比例以及自组装时间,采用差示脉冲伏安法进行定量分析。结果...     

基于荧光共振能量转移的核酸适配体传感器检测环丙沙星

建立了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的核酸适配体传感器,并用于检测实际水体和牛奶中的环丙沙星（CIP）。为了防止羧基荧光素（FAM）被CIP猝灭,FAM和四甲基罗丹明（TAMRA）分别标记在互补单链DNA(FAM-cDNA)和适配体（TAMRA-APT）,通过DNA杂交发生FRET, TAMRA有效猝灭FAM的荧光。CIP加入后,其与FAM-cDNA发生亲和力竞争反应,CIP与TAMRA-APT形成结构更稳定的CIP/TAMRA-APT复合物,使体系FAM的荧光恢复。在优化条件下,本方法对CIP表现出高灵敏度和高选择性,检测浓度线性范围为0.01～1μmol/L,检出限为6 nmol/L;对实际水样和牛奶的加标回收率为90.4%～113.2%,相对标准偏差为1.8%～11%。该荧光适配体传感器具有成本低、灵敏度高、特异性好等优点,在环境中CIP残留快速检测方面具有良好的应用潜力。