智能型金纳米棒荧光探针的制备及其肿瘤细胞成像研究

开发能特异和灵敏检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的智能型荧光分子探针,对于癌症的早期精准诊断与治疗至关重要。本文基于MMP-2特异性识别的多肽底物,利用一价铜离子催化的"点击"化学反应将荧光素(FITC)和多肽底物GPLGVRGY相偶联,与SH-PEG-COOH修饰的金纳米棒在EDC和Sulfo-NHS的作用下通过酰胺化反应,制备得到一种新的MMP-2特异性响应的荧光共振能量转移(FRET)金纳米棒探针GNR@FITC。体外重组酶检测实验、MTT实验及细胞共聚焦显微成像结果表明,该探针对MMP-2过表达小鼠乳腺癌细胞4T1表现出较好的特异性和检测灵敏度,具有进一步开发应用于乳腺癌早期诊断的极大潜力。     

用于无创产前诊断的SRY基因高灵敏高特异检测方法研究

通过检测母体外周血中胎儿游离DNA(cffDNA)的SRY基因,确定胎儿性别,可评估胎儿性连锁遗传病的发病风险,降低病儿出生率.本研究建立了高灵敏、高特异、闭管检测不易污染的实时荧光PCR偶联核酸侵入反应方法用于SRY基因的检测.通过优化反应体系中的检测探针浓度、FEN1酶用量、Taq酶用量及预扩增退火温度,确定了最佳的反应条件,即检测探针浓度为250 nmol/L、FEN1酶用量为7.5 U、Taq酶用量为0.5 U、预扩增退火温度为67℃.在最佳反应条件下,实现对含量低至4%(4 copies/μL)的模拟样本的检测,并成功检测两例孕期分别为9周和10周的临床实际样本.结果表明,所建立的方法可用于母体外周血cffDNA的SRY基因检测,为临床开展基于SRY基因的无创产前诊断提供了新方法.     

基于杂交链式反应信号放大和磁分离技术荧光检测端粒酶活性

端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶, 它一般在癌细胞中被激活. 它与端粒DNA的不断复制以及癌细胞的不断增殖密切相关. 所以检测端粒酶的活性对癌症的早期诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的开发具有重要意义. 利用杂交链式反应(HCR)无酶放大检测信号, 建立了一种简单、快速的端粒酶活性检测方法. 端粒酶延伸产物是一条末端具有(ggttag)_n重复序列的DNA. 在实验过程中, 通过链霉亲合素与生物素的特异性作用将端粒酶延伸产物连接在磁性微球上. 设计一条端粒酶延伸产物特异性的DNA探针I作为杂交链式反应的引发探针. DNA探针I的3'-端与端粒酶延伸产物的重复序列匹配, 通过杂交, DNA探针I被固定在磁球上; DNA探针I的5'-端引发DNA探针II和探针III发生杂交链式反应. DNA探针II和探针III上都标记有荧光基团, 可以利用荧光直接进行信号检测. 在反应过程中, 通过磁分离去除多余未反应的三种DNA探针. 在优化条件下, 可以检测到1.0×10⁵个Hela细胞中的端粒酶活性. 该方法简单、快速、检测成本低, 分析全程无酶参与, 在肿瘤或癌症的临床诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的筛选上具有广阔的应用前景.     

DNA-Lipid探针用于细胞膜外pH值的原位成像

将二酰基脂质体自动偶联到两端标有Cy3和Cy5的具有i-motif结构的DNA链上,形成二酰基脂质体-DNA共轭物(DNA-lipid)探针。二酰基脂质体与细胞膜之间强烈的疏水作用可使该探针直接插入细胞膜表面,实现缺氧和常氧条件下细胞外pH值的比率型检测。在高pH值条件下,具有i-motif结构的DNA链两端的荧光基团处于分离状态,无FRET效应;在低pH值条件下,具有i-motif结构的DNA链在细胞膜表面形成四聚体结构,两端的荧光基团相互靠近,产生强的FRET效应。通过测定两种荧光基团的荧光强度比值实现了pH值的定量检测。利用此探针对pH值的灵敏响应实现了对缺氧环境中细胞外pH值的精确测量,在生理病理学上具有重大意义。     

MOFs传感器在癌症及其生物标志物检测中的应用

癌症是世界上最致命的疾病之一,因此癌细胞的有效捕获和敏感检测对基础研究以及临床诊断和治疗都具有重要意义。基于金属有机骨架(MOFs)的催化活性和固有的发光性能等特点,MOFs已被成功地开发为传感平台实现对癌症及其标志物的检测。综述了基于MOFs的电化学、荧光、电化学发光、比色传感器在癌细胞及核酸、蛋白质等生物标志物检测中近3年的研究进展,从MOFs材料,检测物类型,检测方法、检测能力等方面进行了综述,并对各自的特点进行了讨论,对以后MOFs纳米材料在癌症检测中的应用进行了展望。     

基于量子点-甲酚紫FRET比率探针的活细胞硫化氢成像

硫化氢(H_2S)作为一种重要的气体信号分子,其细胞水平异常与多种疾病的发生发展密切相关。本研究针对现存荧光探针的胞内非特异性响应问题,发展了一种基于量子点-甲酚紫的荧光能量共振转移(F9rster resonance energy transfer,FRET)探针,利用比率荧光分析,实现活细胞内H_2S的灵敏成像。通过一步超声乳化法制备量子点纳米球,再结合叠氮甲酚紫(CV-N_3)制得无机-有机杂化QDS-N3比率探针。此纳米探针尺寸均一,粒径约为120 nm,酸性稳定性高,且无细胞毒性。H2S可将CV-N_3上的N3还原成NH2,生成的氨基甲酚紫(CV-NH_2)作为FRET-受体,吸收量子点纳米球的橙色荧光,产生红光信号。通过两个波长的荧光强度的比率分析可有效消除光源强度波动和细胞内复杂环境等的干扰,最终实现了活细胞内H2S成像。     

羧酸酯酶比率型双光子荧光探针的构建及生物成像研究

羧酸酯酶(CaE)水平的异常与脂肪肝、高血脂等多种疾病的发生密切相关,发展用于快速、准确地检测CaE含量的荧光探针对上述疾病的早期诊断具有重要意义.本文基于分子内电荷转移原理,设计合成了一种对CaE具有高选择性识别的红光比率型双光子荧光探针DCM-CE.CaE催化水解断裂探针分子的酯键,导致酶促反应前后探针的荧光光谱性能发生显著的改变,以此实现对CaE的比率荧光检测.该探针具有较好的选择性、较低的检测下限以及较宽的pH响应范围.此外,我们成功地将DCM-CE应用于活细胞中对内源性CaE的双光子荧光成像.     

基于激发态能量转移机理比率型荧光探针的研究进展

激发态能量转移(Excitation Energy Transfer,EET)作为一类重要的光物理现象,被广泛用于比率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA检测等多个领域.影响EET效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖,通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程,实现对目标客体的双波长比率检测.综述了基于不同供受体荧光团的EET体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响,以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离,获得识别不同客体的比率型荧光探针,并对EET机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望.     

香豆素类比率荧光探针的合成及其对亚硫酸盐与硫化氢的区分检测

基于迈克尔加成反应和分子内电荷转移机理设计合成了一个比率型荧光探针MSP,并将其用于对亚硫酸盐和硫化氢的区分检测。强吸电子基团丙二腈的引入,使得探针的吸收和发射波长红移,同时极大地提高了探针与亚硫酸盐的反应速率,实现了对亚硫酸盐的快速检测。当反应时间延长至3 h时,硫化氢的存在使得探针的荧光波长蓝移至510 nm且强度显著增强,探针在两个波长下的荧光比率(I510/I690)增强约260倍,实现了在不同响应时间和不同光谱通道区分检测亚硫酸盐与硫化氢的目的。该探针具有良好的选择性和竞争性,可分别利用吸收强度比值(A464/A572)和荧光强度比值(I510/I690)定量检测亚硫酸盐和硫化氢,两者检出限分别为0.95μmol/L和0.6μmol/L。该探针还能用于对活细胞内亚硫酸盐和硫化氢的荧光成像。     

一种比率型内源性次氯酸根荧光探针的构建及应用

基于香豆素醛与萘酰亚胺双荧光团构建了一种比率型荧光探针(探针1)。基于C=N双键将香豆素醛与萘酰亚胺连接,增加了探针1整体的共轭度而产生黄绿色荧光。在次氯酸根(ClO~-)的作用下,探针会氧化水解为蓝色荧光的香豆素醛,实现对ClO~-的比率监测。利用吗啉环的定位功能将探针引入到溶酶体内部,RAW 264.7细胞的荧光成像证明探针1可用于内源性ClO~-的比率监测。     

双链特异性核酸酶介导的高灵敏度microRNA分析

基于氧化石墨烯(GO)对荧光标记单链DNA探针的荧光猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA/RNA杂合结构中DNA单链的特性,本文建立了一种新型恒温信号放大方法用于microRNA(miRNA)的高灵敏度检测.靶标miRNA首先与荧光DNA探针杂交,DSN能够特异性地将杂合双链中的DNA探针水解为碎片但不会降解miRNA,GO对酶切产生的寡核苷酸碎片吸附能力显著降低,使得荧光基团远离GO表面而不被猝灭.释放出的miRNA可再次发生与荧光DNA探针杂交、DSN酶切等反应,如此反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大,通过记录体系的荧光信号即可实现对靶标miRNA的灵敏检测.     

基于链置换循环无标记检测端立酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂,SYBRGreen Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针,发夹核酸探针为分子识别探针,基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应,建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA (hTR)的荧光新方法.发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面,嵌插在发夹DNA探针茎部的SG Ⅰ的荧光信号被GO猝灭.当人工合成的目标物(T1)存在时,T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应,由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链.刚性的双链DNA脱离GO表面,导致所嵌插的SG Ⅰ产生较强的荧光信号.基于荧光信号的变化,可定量检测0.2～50 nmoL/L的T1,检出限为90 pmol/L.该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、高特异性且无需标记的荧光新途径.     

谷胱甘肽和凋亡酶-3响应的环肽分子荧光探针

设计、合成了一类新型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和凋亡酶-3(Caspase-3)响应的环肽分子荧光探针.该类探针主要由能量共振转移(FRET)分子荧光对、Caspase-3特异性识别多肽序列和GSH响应双硫键组成,分为不含穿膜肽序列(CP)和包含穿膜肽序列(cp CP)的两种不同环肽分子荧光探针.2种环肽分子荧光探针均能实现在GSH和Caspase-3同时存在情况下的精确成像,同时具有良好的响应性、特异性和高信噪比.该类环肽分子荧光探针在细胞培养环境中具有良好的稳定性和生物相容性.利用该探针,可以实现对星形孢菌素(STS)诱发的细胞凋亡进行实时、原位的成像监测,并对抗肿瘤药物阿霉素(DOX)和顺铂(cisplatin)诱导的细胞凋亡进行成像.这种具有多重响应并能用于精确成像的分子荧光探针将极大地促进疾病的精确诊断.     

基于链置换循环无标记检测端粒酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂, SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针, 发夹核酸探针为分子识别探针, 基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应, 建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA(hTR)的荧光新方法. 发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面, 嵌插在发夹DNA探针茎部的SGⅠ的荧光信号被GO猝灭. 当人工合成的目标物(T1)存在时, T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应, 由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链. 刚性的双链DNA脱离GO表面, 导致所嵌插的SGⅠ产生较强的荧光信号. 基于荧光信号的变化, 可定量检测0.2~50 nmol/L的T1, 检出限为90 pmol/L. 该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、 高特异性且无需标记的荧光新途径.     

HA-AuNPs/FDF用于透明质酸酶的高灵敏检测、肿瘤靶向细胞荧光成像和光疗

本工作构建了一种新型复合纳米诊疗剂HA-AuNPs/FDF,用于透明质酸酶(HAase)的高灵敏荧光检测、肿瘤靶向荧光成像和光动力/光热协同治疗.吡咯并吡咯二酮基共轭小分子(FDF)与肿瘤靶向生物分子透明质酸(HA)功能化的金纳米粒子(HA-AuNPs)通过静电作用自组装形成HA-Au NPs/FDF. FDF在近红外光激发下产生较强的荧光, HA-AuNPs会通过荧光共振能量转移效应(FRET)猝灭FDF的荧光.然而,肿瘤细胞中过表达的透明质酸酶(HAase)能使HA逐渐降解, FDF被释放,从而荧光逐渐恢复. HA-AuNPs/FDF的荧光恢复程度与HAase的浓度有很好的线性关系,可用于快速定量检测HAase.而且, HA-AuNPs/FDF作为透明质酸酶激活的荧光探针成功地用于人宫颈癌肿瘤HeLa细胞的靶向荧光成像,细胞实验结果证实它能通过光动力/光热协同治疗有效抑制HeLa细胞的增殖.该体系为实现精准高效的肿瘤诊疗拓展了思路.     

基于1,8-萘酰亚胺的多分析物荧光探针的构建和应用

生命受细胞内复杂的代谢过程控制。科学界正在进行的努力之一是研究和理解这些动态生化反应以及生物分子在维持生命中的作用。荧光探针具有操作简单、成本低、灵敏度高、可在活体中多通道和实时可视化等优点,已被广泛用于分析物在生理和病理过程中的可视化研究。然而,多数荧光探针只可响应单分析物,不适于复杂生物体系中多分析物的分析检测。近5年来,以1,8-萘酰亚胺为荧光报告基团的多分析物荧光探针在生物或环境领域得到了快速的发展。依据探针荧光发光机制,本文将其分为单发光机制(PET、ICT和FRET)、双发光机制(PET-ICT、PET-FRET和ICT-FRET等双机制协同作用)等方式,综述了国内外基于1,8-萘酰亚胺的多分析物荧光探针在设计策略、识别过程、光学性质和细胞成像等方面的新进展,并对此类荧光探针的发展趋势和挑战进行了展望。     

基于碳量子点-银纳米簇荧光共振能量转移纳米探针的荧光传感器检测转基因成分CaMV35S

利用荧光共振能量转移(FRET)纳米探针结合催化发夹组装(CHA)无酶扩增信号放大途径建立了一种可用于转基因成分的荧光检测方法。首先为CaMV35S目标序列(tDNA)设计了可诱导的CHA循环的两个发夹结构序列HP1和HP2。当单链DNA标记碳点(sDNA-CDs)和DNA模板化银纳米团簇(Ts-AgNCs)杂交后,AgNCs和碳量子点(CDs)靠近,形成FRET效应,得到sDNA-CDs/Ts-AgNCs荧光猝灭的比率荧光探针。当tDNA存在时,通过杂交反应打开HP1发夹,形成HP1-tDNA双链结构;该结构可将HP2的发夹结构打开,从而形成HP1-HP2双链结构,同时释放出tDNA进入下一轮杂交,触发CHA循环。由于HP1-HP2中HP1的部分序列与Ts部分序列间的亲和性较sDNA强,因此,加入sDNA-CDs/Ts-AgNCs后,sDNA-CDs从探针中释放,使CDs(λ_em=464 nm)的荧光得以增强。而AgNCs仍在双链结构中,其荧光强度(λ_em=560 nm)基本保持不变。以I_F464/I_F560...     

基于罗丹明和BODIPY单元的FRET探针的合成及其对小分子α-酮戊二酸的检测

小分子α-酮戊二酸(α-KA)是人体新陈代谢的一种十分重要的产物,与多种疾病存在直接或者间接的关系,可以对临床诊断提供帮助。以BODIPY单元作为能量给体、罗丹明单元作为能量受体,利用二者存在重叠的光谱,本文设计了一种基于罗丹明和BODIPY单元的荧光共振能量转移(FRET)探针,通过将罗丹明与BODIPY的衍生物进行桥联,得到能够检测α-酮戊二酸的荧光比率型探针RDM-BO。研究表明,探针RDM-BO本身的荧光光谱与BODIPY单元类似,当探针与α-酮戊二酸发生反应时,RDM-BO中的罗丹明单元会发生开环反应,使分子的共轭发生变化,同时产生新的荧光峰,检测效果显著,检测限可达到3.14μmol·L-1。     

比率型SO2荧光探针的构建及细胞成像研究

本文构建了一种基于苯并吲哚季铵盐结构的荧光探针用于检测SO₂衍生物。该荧光探针能够快速、灵敏、高选择性地检测HSO₃^-和SO₃^2-,并显示出颜色和荧光变化双重响应。其比率荧光强度（I₄₆₂/I₅₈₈）与HSO₃^-的浓度（0～16 μmol/L）之间具有良好的线性关系,检测限低至12 nmol/L。¹HNMR表明该探针的响应机制为1,4-亲核加成反应。激光共聚焦荧光成像结果表明,CZBI具有良好的细胞膜通透性,并且可以通过比率荧光成像实现对细胞内SO₂衍生物的监测。     

包裹RuBpy二氧化硅荧光纳米探针的制备及其用于肝癌细胞的识别

制备了两种不同官能团修饰的偶联亲和素的包裹钌联吡啶(RuBpy)二氧化硅荧光纳米探针A和探针B,并分别用于肝癌细胞的识别。通过反相微乳液法制备得到表面修饰不同官能团的纳米颗粒,然后通过亲和素与羧基化包裹RuBpy二氧化硅纳米颗粒相互连接而制备得到探针A;通过亲和素与PEG修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒相互作用而制备得到探针B。与探针A不同的是,探针B通过一个长链PEG分子将亲和素与荧光二氧化硅纳米颗粒偶联在一起。利用免疫荧光成像法将这两种探针分别用于人肝癌细胞的识别,结果表明,含有长链PEG分子的探针B更能够有效地识别肝癌细胞表面肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)。