基于三甲基苯磺酰羟胺消除反应的氧连接氮乙酰葡萄糖胺修饰肽段的精准鉴定

氧连接氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它在维持机体正常的生命活动中发挥着重要作用。许多研究证实,O-GlcNAc糖基化修饰稳态的破坏与人类多种疾病的发生相关,大规模富集鉴定O-GlcNAc糖基化修饰蛋白有助于发现新的临床疾病诊断标志物。由于O-GlcNAc糖基化修饰丰度较低,形成的糖苷键不稳定,O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定面临一定挑战。近年来,全乙酰化的非天然糖代谢标记技术被广泛应用于O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。然而,最新的研究发现,在细胞代谢标记过程中,全乙酰化的非天然单糖会同时标记半胱氨酸的巯基而引入半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该副反应在一定程度上干扰了O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。鉴于此,研究发展了一种通过三甲基苯磺酰羟胺(MSH)特异性氧化消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物的方法,进而显著提高O-GlcNAc糖基化修饰肽段的精准鉴定。该方法建立于温和的磷酸钠缓冲液(50 mmol/L, pH=8)体系,利用过量的MSH,于95 ℃避光振荡反应30 min,可完全消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该方法应用于Hela细胞中,可有效消除叠氮全乙酰化半乳糖胺(Ac₄GalNAz)代谢产生的半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物,从而成功富集鉴定到157条O-GlcNAc糖基化修饰肽段,归属于130个蛋白质。该方法有效去除了半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物对代谢标记结果的干扰,为非天然糖代谢标记技术在糖蛋白组学分析中的应用提供了新的研究策略。     

蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组分析方法进展

半胱氨酸的巯基具有很高的反应活性,作为亲核、氧化还原催化反应、金属结合及变构调节位点等在蛋白质的结构和功能中发挥着非常重要的作用,且容易发生多种翻译后修饰,调控亦或损伤蛋白功能,与人类许多重要疾病关系密切,因此,定性与定量分析蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组对理解其生物学功能具有重要意义。本文综述了近年来蛋白质半胱氨酸上常见的翻译后修饰组的质谱和蛋白质组学分析方法进展。     

大肠癌组织棕榈酰化修饰蛋白的组学分析

蛋白质棕榈酰化修饰在大肠癌的发生、发展和转移等过程中发挥了重要作用。本研究采用改进的酰基-生物素交换方法(Acyl-biotinyl exchange, ABE),对大肠癌组织中的棕榈酰化修饰蛋白进行富集,并利用蛋白质组学技术对富集的蛋白进行分析鉴定。结果共鉴定出213种高可信度(+HA/-HA>3)的棕榈酰化修饰蛋白,包括烯醇化酶1、过氧化物氧化还原酶、波形蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、核异质性核糖核蛋白K、分子伴侣复合体蛋白1等,并以烯醇化酶1棕榈酰化修饰为例,采用蛋白质印迹技术对其进行了验证。本研究对经典的ABE方法进行了改进,降低了非特异性背景信号,大肠癌癌组织中的棕榈酰化修饰蛋白的鉴定分析结果可为进一步研究特定肿瘤相关蛋白分子的棕榈酰化修饰调控的分子机制、精准发现大肠癌肿瘤标志物或分子靶点提供新思路。     

硫化氢信号分子与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用机制的研究

硫化氢(H_2S)作为信号分子与目标蛋白相互作用而实现信号传导机制的研究一直是研究热点。本研究以L-乳酸脱氢酶为目标蛋白,选用3种H_2S供体试剂(NaHS、Na_2S、PS),采用分子荧光实时监测L-乳酸脱氢酶活性变化,研究H_2S与目标蛋白的相互作用。SDS-PAGE电泳结果显示,H_2S不是通过形成二硫键/三硫键的方式与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用;圆二色谱结果表明,L-乳酸脱氢酶的二级结构发生变化,提示H_2S可能存在半胱氨酸巯基衍生能力,以硫烷硫存在的PS具有最强的巯基作用力;MALDI-TOF-MS/MS分析结果表明,L-乳酸脱氢酶蛋白中部分半胱氨酸巯基位点发生了硫烷化,进一步揭示了H_2S是通过与活性半胱氨酸巯基位点硫烷化的方式与L-乳酸脱氢酶发生作用。     

半选择性氧化形成三对二硫键合成利那洛肽

利用Fmoc固相合成策略,Wang树脂为载体,使用三苯甲基(Trt)和乙酰胺甲基(Acm)保护基的半胱氨酸合成了3条[4 Trt+2 Acm]和3条[2 Trt+4 Acm]利那洛肽的线性前体化合物.在此基础上,采用半选择性氧化策略合成含有三对二硫键的利那洛肽.首先使用含三氟乙酸(TFA)的裂解剂脱除线性前体肽中半胱氨酸的Trt保护基,并使用氯化血红素催化氧化半胱氨酸自由巯基形成二硫键.下一步使用Ph S(O)Ph/CH3Si Cl3试剂体系脱除剩余保护半胱氨酸的Acm保护基,并同时形成二硫键.使用这种策略,在6条线性前体肽中,有3条可以得到利那洛肽,转化率分别为71.9%、31.5%、81.4%.通过分析6条线性前体肽中二硫键形成的先后顺序对目标产物生成的影响,发现二硫键Cys5-Cys13的形成对利那洛肽的氧化折叠非常关键,在选择性氧化合成利那洛肽时应当优先形成这对二硫键.     

基于蛋白质半胱氨酸的活性蛋白表达谱分析

蛋白质中的半胱氨酸对维持和调控细胞内的氧化还原平衡起着重要作用,同时它们也是多种蛋白质的功能活性位点,参与诸多生理过程。此外,蛋白质中的半胱氨酸上所发生的一系列翻译后修饰也扩展了蛋白质功能的多样性。随着化学蛋白质组学的发展,基于活性的蛋白表达谱(Activity-basedproteinprofiling,ABPP)分析技术在探究蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰方面取得了很多重要的研究成果。本文简要介绍了用于蛋白质半胱氨酸的活性蛋白表达谱分析方法,讨论了针对蛋白质半胱氨酸及其翻译后修饰的蛋白质组学领域的最新研究,并对该领域的未来发展趋势进行了展望。     

含巯基/二硫键聚合物生物材料

含巯基/二硫键聚合物生物材料具有多种良好的性能,作为药物、基因等的释放载体在生物医学领域具有广泛的应用前景。随着基因工程和组织工程的发展,含巯基/二硫键聚合物生物材料的可生物降解性得到高度重视,而怎样改善其降解性能成为限制其应用的关键因素。由于二硫键在细胞外环境里保持稳定,在细胞溶质的还原环境中容易发生断裂,因此在制备新型基因、药物等释放载体上,二硫键充当了重要的角色,它的引入为聚合物生物材料的生物降解性能的设计与改善提供了一条重要的途径。本综述重点以聚合物水凝胶、聚合物微胶束、囊泡等为例,从巯基/烯的光聚合反应、Michael加成反应、氧化还原反应的角度,介绍了巯基/烯在聚合物中形成二硫键的不同途径的研究进展,并详细论述了基因载体、蛋白质载体、小分子药物载体三种还原敏感型材料的制备、表面修饰和改性的进展情况,进一步强调含巯基/二硫键聚合物生物材料的研究在生物医学领域应用的重要性。     

A型流感病毒血凝素蛋白S-棕榈酰化修饰的质谱分析

蛋白质S-棕榈酰化修饰是指棕榈酸分子通过硫酯键共价结合在蛋白质分子的半胱氨酸( S)的巯基侧链上,是蛋白质脂类修饰的重要形式之一,在细胞信号转导、代谢等过程中起着重要作用。本实验首先利用酰基-生物素置换反应,将A型流感病毒血凝素蛋白上的S-棕榈酸分子转换为含有生物素( Buotun)分子的标签。生物素标记蛋白经特异性富集、电泳分离纯化后,进行胶内水解。再利用质谱技术对水解混合物进行分析。结果表明,经酰基-生物素置换方法处理A型流感病毒裂解产物后,蛋白质耦联生物素的浓度(羟胺处理,＋Hydroxylamune)与空白对照组(未加羟胺处理,-Hydroxylamune)的比值大于3;对经富集后的流感病毒血凝素蛋白进行了质谱分析,鉴定了 A 型的两个 S-棕榈酰化修饰位点,分别位于蛋白羧基末端的 Cys562和Cys565。本研究为大规模研究S-棕榈酰化修饰蛋白提供了一种特异、有效的分析方法。     

氧化型肌酸激酶的研究

利用NR/R双向对角线SDS-PAGE作者首次将过去被认为均一的兔肌肌酸激酶分离为含有链内二硫键的和不含任何二硫键的两种肌酸激酶(前者称为“氧化型肌酸激酶”,后者称为“还原型肌酸激酶”)。它们具有相同的化学组成,相同的亚基分子量,相同的等电点及几乎相同的催化活性,因此用一般常用的分离纯化手段很难将它们分离开来。进一步的研究表明,氧化型的肌酸激酶也含有一对表面巯基,并对酶的活性同样是必需的。氧化型肌酸激酶分子中,每一个亚基含有一个链内二硫键,在没有变性的条件下,不能被DTT还原,而还原型肌酸激酶通过某些氧化剂氧化可以形成这个二硫键,因此作者认为该二硫键可能是由内埋较浅的一对巯基氧化而成的。     

用电喷雾质谱法监测重组人肿瘤坏死因子中二硫键的还原过程

应用电喷雾质谱方法动态监测了用巯基乙醇及二硫苏糖醇还原重组人肿瘤坏死因子中二硫键的全过程,表明使用巯基乙醇还原二硫键速度较二硫苏糖醇快,并且在还原过程中有质量加和产物生成,还原过程易于观察,可为进一步对蛋白质酶切进行结构鉴定提供监测方法;利用该法还可测定分子中二硫键的数目。     

选择性氧化形成三对二硫键合成齐考诺肽

利用不同保护基保护的巯基的氧化反应性不同,分别以空气和碘作为氧化剂,通过选择性氧化工艺使齐考诺肽线性肽的1,8,16,20-位两对Trt保护巯基先形成两对二硫键,然后用碘氧化15,25-位Acm保护的巯基,成功地生成第三对二硫键,合成了齐考诺肽.     

巯基—二硫键交换在胰岛素与其受体结合中的作用

本文报道DTT还原,DTNB氧化以及NEM修饰对小鼠肝膜巯基含量和与胰岛素受体特异结合的影响。DTT还原导致膜巯基含量和与胰岛素特异结合平行增加,Scatchard分析表明胰岛素结合位点的数目仅有微小变化,但结合常数增高到原来的二倍。用含有DTT的缓冲液洗涤已饱和结合了胰岛素的膜比用不含DTT的缓冲液,导致结合在膜上的胰岛素解离下来的量明显升高,说明有一部分胰岛素与其受体的结合是通过巯基—二硫键交换反应形成共价的二硫键。加入DTT使这种“二硫键联接”的胰岛素也从受体上解离下来。DTNB或NEM对膜与胰岛素的特异结合几乎没有影响,但对已被DTT还原的膜似有逆转DTT还原的效应,推测,鼠肝膜胰岛素受体上可与胰岛素发生共价结合的巯基中,有一部分是不能与DTNB发生反应的,DTT处理膜使胰岛素受体产生更多的巯基而使胰岛素特异性结合,特别是使通过共价二硫键的结合增加。     

纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰

多肽组是指生物体表达的所有多肽,尿液等体液的多肽组是生物标记物的重要来源.本研究采用氧化石墨烯-磷酸镧纳米磁性复合材料分离富集尿液多肽,进行纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析,从单一样本中鉴定了归属于123个蛋白质的790条肽段.研究表明,这些肽段在蛋白质水平上不是平均分布的.此外,本研究检测到了肽段的氧化、磷酸化和脱氨化等翻译后修饰现象,观察到了尿液多肽的阶梯序列性,从蛋白水平上对尿液多肽组进行了生物信息学分析,结果表明,这些多肽所归属的大部分蛋白质之间存在相互作用.本方法可为在尿液中寻找疾病的标志物提供方法学支持.     

规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象

对蛋白质样品制备中引入的氨基酸残基的一种现象--蛋白质酶切肽段氨基端的环化修饰现象的初步研究结果显示,很多以谷氨酰胺(Q)或氨乙酰化修饰的半胱氨酸(CAM_C)残基起始的肽段会发生氨基端的环化修饰,且修饰反应不完全,在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在,并且环化修饰后的肽段的反相色谱保留时间发生延迟.在数据库检索时添加环化修饰,可以提高蛋白质的鉴定成功率.本研究结果为大规模的蛋白质质谱数据解析提供了有价值的参考.     

新型含二硫键的环肽的合成

本实验设计从Boc-Glu-OH,Boc-Asp-OH的两个羧基出发,最后通过I2氧化两个半胱氨酸的巯基生成二硫键,得到一类新型含二硫键的环肽,该环肽通过1H NMR,MS等确定了其结构.     

液相色谱-质谱联用分析流感病毒感染引起宿主蛋白类泛素化修饰

干扰素刺激基因15编码蛋白质(Interferon stimulated gene 15 kDa protein, ISG15)是最早被鉴定的类泛素分子蛋白质,在病毒感染和免疫调节等方面具有重要作用。本研究利用免疫沉淀技术将被类泛素 ISG15修饰的蛋白富集纯化,采用液相色谱-质谱联用技术对流感病毒感染 A549宿主细胞过程中产生的类泛素 ISG15修饰蛋白进行了分析。实验结果表明,在流感病毒感染的实验组 A549细胞中,鉴定到了22种来源于宿主细胞的ISG15修饰的蛋白,包括类泛素蛋白 ISG15、细胞周期蛋白-T1、热休克蛋白71、钙调素结合蛋白、真核翻译起始因子等,以及1种来源于流感病毒的非结构蛋白 NS1。在鉴定的22种宿主蛋白中,有6种蛋白在未感染病毒的对照组 A549细胞中也得到鉴定,包括膜联蛋白 A1、果糖二磷酸醛缩酶 A、线粒体三磷酸腺苷合成酶亚基 g、烯醇化酶、肌动蛋白、微管蛋白。生物信息学分析表明,流感病毒感染引起的 ISG15修饰的宿主蛋白分别归属于9个不同的蛋白分类,包括细胞骨架蛋白、分子伴侣蛋白、酶调节剂、核酸结合蛋白、激酶类、转移酶类、转录因子、氧化还原酶类以及结构蛋白。本研究为大规模分析鉴定 ISG15修饰蛋白提供了一种特异、有效的研究方法。     

应用部分保护肽片段的硫酯合成c-Myb蛋白(38—89)-NH_2

本文研究了应用4-甲基苄基氯选择性保护肽片段中的半胱氨酸巯基,用部分保护肽片段的硫酯合成了c-Myb蛋白(38—89)-NH_2,由4-甲基苄基保护的巯基在硫酯的银离子活化条件下很稳定,该方法可用于含半胱氨酸蛋白质的化学合成。     

壳聚糖的改性及其纳米粒子的制备

通过壳聚糖上的氨基与硬脂酸和硫辛酸的羧基脱水缩合反应,将硬脂酸和硫辛酸接枝在壳聚糖上,引入的疏水性基团使修饰的壳聚糖具有两亲性。对修饰壳聚糖残留的自由氨基进行甲基化,使氨基的pKa值由6.6增加到6.8~7.1。修饰的壳聚糖在水介质中经超声分散即可形成纳米粒子,纳米粒子的Zeta电位为正值,说明修饰壳聚糖中残留的氨基和甲基化的氨基处于纳米粒子的表面。纳米粒子经二硫苏糖醇还原,然后经空气中的氧气氧化,在纳米粒子中形成二硫键交联结构。     

蛋白质的化学全合成

含有非天然氨基酸的蛋白质（如翻译后修饰蛋白质、修饰有探针分子的蛋白质等）是化学生物学中重要的生理活性分子。这些分子难以通过生物表达来获取，而必须使用化学方法来合成。半胱氨酸肽片段连接方法是目前应用于蛋白质化学全合成中的一种重要方法，该方法能够在温和的水溶液中高效地实现肽片段的连接，从而生成天然或者非天然的蛋白质。本文系统地综述了半胱氨酸肽片段连接方法的基本原理，详细讨论了近年来人们对该方法的一些重要改进。最后又介绍了该方法在几类重要的蛋白质分子合成中的代表性应用。     

中国蛇岛蝮蛇毒蛋白的电泳结合串联质谱法分析

采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对中国辽宁蛇岛蝮(Gloydius shedaoensis)蛇毒(GSSV)进行分离,染色结果显示该蛇毒中含有多种相对分子质量为12 ～85 ku的蛋白组分.凝胶上切割的蛋白带经胶内二硫苏糖醇(DTT)还原和碘乙酰胺(IAM)修饰后进行胰蛋白酶水解,所得肽段采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-nESI MS/MS)进行分析,蛋白鉴定采用Sequest Bioworks软件搜索NCBInr数据库完成.从GSSV中鉴定出超过25种蛋白组分,主要包括:酸性磷脂酶A2、碱性磷脂酶A2、神经生长因子、突触前神经毒素、出血因子、类凝血酶、丝氨酸蛋白酶、糖原合酶、金属蛋白酶、成熟酶、L-氨基酸氧化酶、纤溶酶源激活物、外源凝集素、富含半胱氨酸分泌酶、去整合素、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原凝固抑制因子A、血管凋亡诱导蛋白1、氨甲酰基磷酸合成酶、吡喃糖-2-氧化酶以及ablomin,catrin,mucrofirase,pallabin,salmosin和triflin的同源蛋白.