Ca2+对诱导大肠杆菌摄取外源DNA的影响

将CaCl2诱导大肠杆菌建立感受态及其质粒的转化过程进行逐一分解,根据转化效率探讨了Ca2+在各个步骤中的作用.结果发现,Ca2+并不能永久性地改变细胞的结构和生理状态;细胞只有在Ca2+存在下才能维持其摄取DNA的能力;在诱导大肠杆菌摄取DNA的过程中,Ca2+主要是在转化步骤中起作用,转化前是否用Ca2+处理或处理时间长短对大肠杆菌摄取DNA能力影响不明显.     

通过DNA释放及感受态建立进行的枯草杆菌细胞间自然转化

以平板转化法研究了枯草杆菌在液体基本培养基 (MM)及LB中培养时通过DNA释放和感受态建立进行的细胞间自然转化 .结果表明 ,该菌在这两种培养基中培养时均可在对数生长期向培养液中主动分泌有生物活性的DNA ,且细胞间接触有利于转化过程的进行 ,暗示在本实验条件下DNA供体细胞可能具有某种主动功能 .对感受态建立的研究表明 ,不仅是MM培养物 ,而且通常被认为不能形成自然感受态的LB培养物 ,当涂布于MM选择平板后均可利用细胞分泌或提取的DNA进行自然转化 ,其转化高峰均出现在对数生长末期 ,转化频率分别可达到 3× 10 -3 和 1.9× 10 -6.     

亚硒酸钠诱导HeLa细胞凋亡机理

对亚硒酸钠诱导人宫颈痛细胞（HeLa）凋亡进行了研究，分别用荧光倒置显微镜和流式细胞仪进行凋亡形态分析和DNA片断分析．研究发现Na2SeO3对HeLa细胞的凋亡作用呈现浓度依赖性，当Na2SeO2的浓度分别为21．42，63μmol／L时，流式细胞仪检测到的细胞凋亡率分别是18．9％，33．0%，58．95．为了进一步说明凋亡过程的分子机理，分别使用Frua-2／AM和DCFH-DA两种荧光染料检测了用Na2SeO3诱导的细胞内游离Ca^2＋含量和活性氧（ROS）水平的变化。发现在凋亡过程中伴随有明显的胞内Ca^2＋和ROS水平丌高，且呈现Na2SeO3浓度卡相关性，这表明Ca^2＋和ROS在Na2SeO3诱导的HeLa细胞捌亡过程中起着重要的信号传导作用。     

应用镧探针对不同心功能心脏病人活检心肌通透性观察

在心力衰竭发生和演变过程中,心肌细胞膜的损伤程度起重要的作用,以往的研究证实镧 离子可作为心肌通透性的示踪元素,本文应用镧探针对四种不同心功能心脏病人及健康人活检心肌的通透性进行对比性研究,发现镧颗粒以不同程度渗透进入心肌细胞膜,肌原纤维及接的肌膜的线粒体,它们的通透程度与心功能状态一致,提示这些改变对了解心力的机制十分重要。     

类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达

根据大肠杆菌密码子偏好性,优化人胰岛素原基因序列,同时用2个赖氨酸取代C链。重叠PCR扩增法克隆优化的类人胰岛素原基因,PCR扩增引物中引入胰蛋白酶酶切位点和核酸限制性内切酶识别位点。经酶切、拼接获得类人胰岛素原多拷贝基因,并构建人胰岛素原基因多拷贝原核表达载体,转化感受态大肠杆菌诱导表达融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳,考马斯亮兰染色和融合蛋白染色条带光密度分析表明,含有4拷贝的类人胰岛素原重复基因序列原核表达载体的诱导表达类人胰岛素原效率最高,是单拷贝类人胰岛素基因原核表达载体表达效率的3倍左右。表达产物经质谱鉴定,确定为优化设计的类人胰岛素原,表明构建的多拷贝类人胰岛素原基因表达载体可应用于后续人胰岛素原的高效表达生产研究。     

受乳糖启动子控制的基因表达过程的优化

借助于ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析方法，对乳糖诱导的由乳糖启动子控制的大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０因子基因表达过程进行了优化研究．结果表明，含此融合基因的大肠杆菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＧＥＭＤ的生长量达到ＯＤ６００ｎｍ＝１．０时，用终浓度为０．０８％的乳糖进行连续５ｈ的诱导，可使大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶σ７０因子基因的表达量达到最大，并达到ＩＰＴＧ同样的诱导效果．流加低浓度的乳糖溶液能增加σ７０因子的合成量，但是促进作用不很显著．     

TNF-α联合H2O2诱导对大鼠心肌细胞氧化应激和炎症损伤的影响

为探究TNF-α联合H₂O₂诱导对大鼠心肌细胞氧化应激和炎症损伤的影响，建立更贴近于心肌细胞氧化应激和炎症损伤模型，采用200μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h联合80 ng·mL^-1 TNF-α作用H9c2细胞12 h,通过CCK-8、ELISA以及流式细胞术等实验，发现氧化应激指标MDA水平增高，抗氧化酶SOD降低，NF-κB信号通路下游炎症相关的蛋白表达和mRNA表达增强。说明200μmol·L^-1 H₂O₂作用1 h联合80 ng·mL^-1 TNF-α作用12 h共同刺激H9c2细胞，可诱导大鼠心肌细胞氧化应激和炎症损伤，其作用机制可能与靶向调控NF-κB信号通路有关。     

两种诱导因子对新疆甜瓜愈伤组织某些抗病相关酶系的诱导

用两种诱导因子对新疆甜瓜愈伤组织继代培养物进行诱导的结果表明；９１）苯丙烷类代谢关键酶系的活性和木质素含量在诱导扣均有不同程度的增高，与整体诱导相似，且理炙迅速；（２）可溶性蛋白电泳分析表明，两种诱导因子和对照三者之间都有谱带差异；（３）可以初步认为，这两种诱导因子对整体抗性的诱导是与苯丙烷类系活性增高，木质素含量增加密切相连的，并且这些生理生化变化在愈伤组织水平是这两种性质不同的诱导因子直接作用     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶的表达及抗体制备

以禽流感病毒A／chicken／Hubei／489／2004（H5N1）NA基因全长eDNA克隆pMD-NA为模板，PCR扩增第406位至第1353位基因片段。克隆到pET-28a表达载体，构建重组质粒pET-28／ANA，转化大肠杆菌，用异丙基口硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE和Western blot分析证实，截短的NA重组蛋白获得高效表达。采用SDS-PAGE纯化重组蛋白，免疫家兔，制备特异性神经氨酸酶（NA）抗体。ELISA及间接免疫荧光检测结果显示，该抗体效价在1：1×10^5以上，能与在大肠杆菌和Vero细胞中表达的NA蛋白产生特异性反应。纯化的NA重组蛋白可用作建立禽流感检测方法的诊断抗原，所制备NA抗体可用于检测禽流感基因工程疫苗中的NA抗原组分。     

2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶在毕赤酵母中的分泌表达

为实现2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶基因(DERA)在毕赤酵母中分泌表达。通过PCR从E.coli BL21基因组中扩增获得DERA序列,并且与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建得到重组质粒pPIC9K-DERA。重组载体经salⅠ单酶切线性化后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞,用MD/MM平板筛选阳性株并在含G418的YDP培养基中筛选多拷贝插入菌株。经PCR鉴定获得一株插入pPIC9K-DERA的多拷贝嗜甲醇重组毕赤酵母菌株。用甲醇诱导该重组菌株,分泌得到具有活性的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶,且72 h时酶活为2.4 U·mg-1。结果表明,2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶可实现在毕赤酵母中分泌表达。     

大肠杆菌在低Ca~(2 )条件下对外源DNA的摄取

含一定浓度 Ca2 的 L B培养基 ,接种大肠杆菌 HB10 1,37℃振荡培养至 OD6 0 0 为 0 .5左右 ,培养前或培养后加入 p BR32 2质粒 ,4℃放置一段时间后经氨苄青霉素筛选和质粒检测发现 ,大肠杆菌不经过高 Ca2 下的冰浴处理和热激活等过程就能够直接摄取外源 DNA;通过对转化子质粒拷贝数和氨苄青霉素抗性测定发现 ,这种转化方式进入菌体内的质粒 DNA同样能够进行有效的复制和表达 ,与传统的人工转化结果无本质区别 ;在一定范围内 ,大肠杆菌的转化频率与环境中的 Ca2 浓度成正相关 ,并且这种准自然条件下的转化需要一定的时间 .实验结果对揭示大肠杆菌可能具有自然遗传转化的能力以及正确评估基因工程微生物的安全性具有重要意义     

固定化新月菱形藻的制备及其对N、P吸收的影响

为优化固定化新月菱形藻(Nitzschia closterium)在污水中去氮、磷的效果, 以褐藻酸钠为固定化载体, 采用单因子试验方法, 研究了不同包埋藻细胞密度(0、0.27×107、0.81×107、1.35×107、1.89×107、2.43×107 cells?mL-1), 不同藻球直径(2.5、3.0、3.5、4.0mm), 3% CaCl2溶液不同加固时间(0、1、2、4、6、8h)、不同藻球用量(0、7.5、15.0、22.5、30.0、37.5g?L-1)和不同加固时间下反复使用次数对氮、磷的去除效果. 结果表明: 包埋藻细胞密度为1.35×107 cells?ml-1时单位藻细胞去除NH4+-N和PO43--P的效果较好. 藻球规格对NH4+-N和PO43--P去除效率的影响不显著(P>0.05). CaCl2加固时间2~8h对藻球中藻细胞生长、NH4+-N和PO43--P去除率没有显著影响(P>0.05), 但均显著高于加固1h, 未经加固的藻球极易破损. 藻球投放质量越大, NH4+-N和PO43--P的去除速度越快, 投放量为30g?L-1, 培养9d后, NH4+-N和PO43--P去除率可达80%以上. 固定化藻球反复使用3次以上, 其NH4+-N和PO43--P的去除效率下降. 由此得出: 固定化新月菱形藻球包埋藻细胞密度以1.35×107 cells?mL-1, 藻球直径3.5mm为佳; 藻球制作时在3% CaCl2溶液中加固最佳时间为2h; 藻球用量为30g?L-1; 对藻球定期(9d)进行加固, 有利于增加藻球使用寿命, 并保持其较好的氮、磷去除率.     

黄杆菌(Flavobacteriumsp.)ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌 ATCC2 75 5 1的 opd基因在大肠杆菌中的表达 ,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定 .通过 PCR扩增和 PCR产物直接克隆 ,将黄杆菌质粒上的一段长达 1137bp的 opd基因进行扩增及克隆 ,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体 p ET2 8b( )上 ,转化宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3) ,经 IPTG诱导 ,获得了较高量的基因表达产物 .该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内 ,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带 .工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平     

F15L和K207E突变与Borrelia螺旋菌磷脂酰胆碱合成酶的生物活性

磷脂酰胆碱合成酶是磷脂酰胆碱合成酶(PCS)途径中的关键酶.根据Borrelia burgdorferiBB0249ORF的DNA序列设计引物对,从B.afzelii总DNA中扩增出一段660 bp DNA.序列分析发现扩增的DNA片段编码的蛋白中仅两个氨基酸(L15和E207)不同于B.burgdorferiBB0249 ORF编码的蛋白(F15和K207).将克隆的基因插入pET表达载体,并在大肠杆菌中表达.在活体中进行的活性分析发现,克隆的DNA片段编码的蛋白质能利用外源的胆碱和大肠杆菌细胞内的CDP-二酰基甘油合成磷脂酰胆碱(PC),表明螺旋菌磷脂酰胆碱合成酶15位的苯丙氨酸和207位赖氨酸残基分别被亮氨酸和谷氨酸替代并不影响磷脂酰胆碱合成酶的活性.     

铜离子注入医用热解碳的抗菌性能

用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌,研究了铜离子注入医用热解碳后的抗菌性能.铜离子注入能量为70keV,注入剂量为5×1014～1×1018ion·cm-2.抗菌实验结果表明,铜离子注入样品后对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抗菌效果;抗菌率随注入剂量的增加而提高,在注入剂量接近饱和剂量1×1018ion·cm-2时,抗菌率达到100%.应用卢瑟福背散射(RBS)分析技术,分析了热解碳中铜离子的分布,并初步探讨了铜离子的抗菌机理.     

3种引进的耐盐观赏树种耐盐能力比较

以从美国引进的观赏树种秋橄榄（Elaeagnus umbellata）、沙枣（E．angustifolia）和美国白蜡（Fraxinus americana）2年生苗为材料,在高含盐量（0．8％）、中含盐量（0．6％）、低含盐量（0．2％）3种不同盐地上进行耐盐性试验．结果表明：3种树种的成活率、株高、地径、冠幅、分枝5项指标随盐浓度的增加都呈递减趋势,其中美国白蜡在高盐地的成活率较高,耐盐性较强．生理指标显示3种植物都具有较好的耐盐性,且耐盐性由强到弱为美国白蜡〉秋橄榄〉沙枣,其中秋橄榄、沙枣适合种植于中低盐地,美国白蜡可种植于中高盐地．     

加权Linnik泛函与随机向量概率密度的L1估计

设,令Dw由满足下述条件的n维随机向量X=(X1,X2,?Xn)组成：E(w(X))=n,E(｜X｜2w(X))=n(n+2)/3,E(〈X, w(X)〉)=-2n(n-1)/3,及E(Xiw(X))=0,1≤i≤n.此处表示梯度,＜,＞是Rn中普通内积,E()为数学期望。加权Linnik泛函定义为：本文主要证明：如果f(x)是X∈Dw的联合概率密度函数且则其中G(x)是n维Gauss分布的密度函数,An-1是球面Sn-1的面积。     

海藻酸／明胶共混膜结构表征及性能

由海藻酸钠和明胶的水溶液共混,在5％（质量分数）的CaCl2水溶液中凝固,然后1％（质量分数）的HCl水溶液处理,成功制得海藻酸／明胶共混膜,采用红外光谱,X－射线衍射,原子吸收光谱,扫描电镜对共混膜进行了结构表征,并对共混膜的透光率,吸水率及力学性能进行了测试,结果表明,共混膜中海藻酸与明胶分子间存在着强的相互作用及良好的相容性,其中Ca^2 交联和海灌酸与明胶分子间静电作用使共混膜力学性能是到了显著改善,此共混膜可望成为一种潜在的伤口包扎,止血及人造皮肤材料。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E1在小鼠和家兔中免疫应答研究

探讨丙型肝炎病毒包膜蛋白E1作为丙肝候选疫苗的可行性．用大肠杆菌表达的非糖基化HCV(丙型肝炎病毒)E1包涵体蛋白免疫小鼠和家兔，分析该包涵体蛋白在小鼠和家兔中所引起的免疫应答及其安全性．该E1蛋白具有良好的免疫原性，能诱导小鼠和家兔产生针对E1的特异性体液免疫应答．小鼠CD8^ T细胞数量在免疫后有明显升高．免疫小鼠未见明显的毒副作用．推测HCV E1这种包涵体结构可能有利于E1抗原的呈递．而HCV E1蛋白的糖基化并不是其免疫原性所必须的．     

昆虫细胞凋亡蛋白酶caspase-1的表达纯化及活性分析

依赖于天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶(caspase)在细胞凋亡途径中起着不可替代的关键酶作用.本研究采用原核表达载体pET32a表达和纯化了家蚕细胞Bm-caspase-1及粉纹夜蛾细胞Tni-caspase-1蛋白酶,序列分析表明二者具有相同的内部剪切识别序列,且酶活性位点均为QACQ↓G.纯化获得大量可溶性蛋白酶,Western-blotting分析表明Bm-caspase-1在大肠杆菌中已自我剪切活化,而Tni-caspase-1没有自我剪切,无酶活性;活性Bm-caspase-1蛋白酶对caspase-3特异性底物Ac-DEVD-AMC的降解酶活性可被Z-VAD-FMK呈剂量依赖性抑制,半抑制浓度约20nmol/L.此外,活性Bm-caspase-1蛋白酶能够转活化无活性的Tni-caspase-1蛋白酶原.结果揭示了昆虫细胞caspase同样具有与哺乳动物细胞caspase相似的底物降解活性并可相互剪切激活,为进一步研究昆虫细胞凋亡的分子途径奠定了基础.