精恶唑禾草灵酶联免疫吸附分析方法研究

建立了测定精恶唑禾草灵的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),合成了精恶唑禾草灵的半抗原精恶唑禾草酸(hapten).通过碳二亚胺法将精恶唑禾草酸交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原,通过活泼酯法将精恶唑禾草酸交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原,Hapten-BSA为免疫原制备了精恶唑禾草灵的兔抗血清,间接非竞争酶联免疫吸附分析方法测得其效价达1.024×105.确定了0.3 mol/L Na+强度的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)和10%的甲醇为精恶唑禾草灵间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件.本方法的IC50为(0.084±0.012)mg/L,检出限(IC10)为(0.0064±0.002)mg/L.对大部分芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂,如精喹禾灵、氰氟草酯、高效吡氟甲禾灵没有明显的交叉反应,对于恶唑酰草胺有一定的交叉反应,这与两者的结构有关.     

烯效唑酶联免疫吸附分析方法研究

合成了半抗原烯效唑琥珀酸半酯,分别将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了免疫抗原和包被抗原,并成功建立了水和土壤中烯效唑残留的酶联免疫吸附分析法。用免疫抗原免疫新西兰大白兔得到多克隆抗体,抗体的效价达到1.02×106。方法的线性范围为0.005～10mg/L,检出限为1.82±0.83μg/L。除烯唑醇有一定的交叉反应外,与大部分三唑类杀菌剂都没有明显的交叉反应。在水和土壤中添加不同浓度的烯效唑,回收率分别在82.40%～105.92%和92.42%～100.08%之间。     

联苯菊酯酶联免疫吸附分析方法研究

建立了定量测定联苯菊酯的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。利用联苯菊酯的代谢物联苯醇合成了联苯菊酯的半抗原LBc(2-甲基-3-苯基苄基氧基羰基丙酸)和LBy(2-甲基-3-苯基苯甲酸)。通过碳二亚胺法将LBc交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原(LBc-BSA),通过活泼酯法将LBc和LBy分别交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原(LBc-OVA和LBy-OVA),LBc-BSA为免疫原制备了联苯菊酯的兔抗血清,间接非竞争酶联免疫吸附分析方法测得其效价达5.12×104。通过同源异源分析,发现异源分析的灵敏度较高,对pH值、离子强度、甲醇含量等影响因素进行了研究,0.3mol/L钠离子强度的磷酸缓冲液(pH7.5)和30%的甲醇确定为联苯菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件,该方法的IC50为2.16±0.32mg/L,检出限(LDL)为0.016±0.002mg/L。对大部分拟除虫菊酯,如三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和拟除虫菊酯的代谢物3-苯氧基苯甲酸没有明显的交叉反应。     

氨基甲酸酯类杀虫剂速灭威酶联免疫吸附分析方法研究

利用间-甲酚和β-丙氨酸合成了速灭威半抗原β-(间-甲基苯氧基羰基)氨基丙酸(HOM)。通过活泼酯法将HOM交联于牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上;HOM-BSA为免疫原制备了速灭威的兔抗血清,ELISA法测得其效价高达1.28×106,交叉反应测定表明抗体方法特异性识别速灭威。对离子强度等影响因素进行了研究,确定了速灭威酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的最佳工作条件,建立了定量测定速灭威的间接竞争ELISA方法,结果表明,该方法检测线性范围为1~10000μg/L;IC50为40.74μg/L;检出限为0.08~0.10μg/L;批内相对标准偏差为2.9%;批间相对标准偏差4.6%。土壤、稻谷和水中的平均添加回收率分别为80%、93.4%和107%。本研究建立了一种快速检测环境和农产品中速灭威残留的有效方法。     

S,S-氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法研究

合成了S,S-氰戊菊酯的半抗原S-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸-α-S-(N-丁酸基)-甲酰氨-(3-苯氧基)苄酯(Efvb).半抗原通过混合酸酐法与卵清蛋白(OVA)偶联作为包被抗原,活泼酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫抗原.用免疫抗原免疫新西兰大白兔,得到抗S,S-氰戊菊酯多克隆抗体.通过异源分析及检测条件优化,确立了间接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件为pH 7.4,0.4 mol/L Na+、40％甲醇-PBS溶液,建立了S,S-氰戊菊酯酶联免疫分析方法.方法的抑制中浓度(IC50)值为(3.16±0.01)mg/L;检出限(IC10)为(0.0053±0.0012) mg/L.对甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯及其代谢物戊菊酸没有明显交叉反应.在自来水、河水和土壤样品中添加S,S-氰戊菊酯,其回收率分别为82.3％～108.2％,83.1％～109.2％和72.0％～91.2％.     

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定氰戊菊酯

采用活性酯法,将氰戊菊酯半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]-4-氨基丁酸与载体蛋白共价偶联合成突出氰戊菊酯分子结构特征的人工抗原和包被原.以人工抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,采用(NH4)2SO4分步盐析和DEAE纤维素柱层析法从抗血清中分离纯化对氰戊菊酯具特异性亲和力的抗体,采用活性酯法,以辣根过氧化物酶标记半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]-6-氨基己酸.采用固定抗体、氰戊菊酯和酶标半抗原直接竞争结合固相抗体的模式, 建立对氰戊菊酯具高特异性的酶联免疫吸附分析方法.在优化条件下, 测定氰戊菊酯标样检测的线性浓度范围为0.001～10.0 mg/L; 检出限0.001 mg/L; 相对标准偏差(RSD, n=5)为9.19%.小白菜中分别添加0.10和5.0 mg/kg氰戊菊酯,直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定,重复6次,回收率分别为83.8%～109%和93.6%～110%; RSD分别为11.7%和7.25%.对实际样品的有效检出限为0.007 mg/L.其它常用拟除虫菊酯类杀虫剂(氯氰菊酯、溴氰菊脂、功夫菊酯、醚菊酯、联苯菊酯)不干扰氰戊菊酯的测定.     

吡氟禾草灵的高效液相色谱法拆分与测定

在流动相为正庚烷-异丙醇-三氟乙酸(99.3:0.5:0.2,体积比),流速为0.6 mL·min-1,检测波长为273 am,柱温为10℃的分析条件下,利用手性色谱柱Nucleosil chiral-2实现了吡氟禾草灵对映体的手性分离,在优化的色谱分离条件下,R-型异构体的峰面积与其对应浓度之间保持线性关系,其对应的线性回归方程为A=(236.30ρ 1.94)×100,其相关系数为0.9991.据此可定量测定R型异构体.     

吡虫啉的酶联免疫吸附分析方法研究

通过碳二亚胺法将吡虫啉交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原,混合酸酐法将吡虫啉交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原,免疫Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选、克隆,得到抗吡虫啉单克隆抗体,抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体效价达1×107,确定了吡虫啉酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的最佳工作条件,建立了定量测定吡虫啉的间接竞争ELISA方法。本方法的IC50为(15.12±1.28)μg/L,检出限为(1.76±0.02)μg/L。与其它吡虫啉结构类似物无交叉反应。批内相对标准偏差为4.5%;批间相对标准偏差5.1%,饮用水、重庆理工大学地下水和重庆市花溪河地表水平均添加回收率分别为102%,97%和85%。本研究建立了一种快速检测环境水中吡虫啉残留的方法。     

细交链孢菌酮酸酶联免疫吸附分析方法研究

采用水合肼和乙醛酸依次对细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)进行衍生化,设计合成了含有氮杂共轭双键偶联手臂,可增强免疫效果的半抗原TeAHGA.通过偶联载体蛋白BSA后的免疫原TeAHGABSA免疫新西兰大白兔,成功制备了特异性识别TeA水合肼衍生物TeAH的多克隆抗体;优化确立了ELISA最佳反应条件(TeAH-OVA为异源包被原、包被浓度0.156 μg/L、药物稀释及反应缓冲液为PBS、一抗反应时间40 min、二抗反应时间20 min),建立了TeA间接竞争ELISA(icELISA)检测方法,其抑制中浓度(IC50)为1.61 μg/L,检出限(LOD)为0.08 μg/L,定量线性检测范围为0.19～12.89 μg/L (IC20～IC80).番茄、面粉样品平均添加回收率分别为67.2％～89.8％和74.8％～93.7％.     

噻虫嗪单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法的建立

通过化学修饰合成了噻虫嗪人工半抗原,采用碳二亚胺法将该半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,成功制备了分子结合比合理的免疫原和包被原。经过免疫原免疫6周龄Balb/c小鼠、PEG介导免疫鼠脾细胞和骨髓瘤细胞的融合和阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化,获得了效价高达1∶6.4×105的抗噻虫嗪单克隆抗体,抗体亚类为IgG1型。优化了ELISA实验条件,建立了基于单克隆抗体技术的噻虫嗪残留间接竞争ELISA方法。本方法的抑制中浓度(IC50)为0.0255mg/L,检测灵敏度(IC20)为0.0022mg/L,检出限(IC10)为0.001mg/L。除噻虫胺外,该抗体与其它噻虫嗪结构类似物无交叉反应。以自来水为基质的噻虫嗪添加回收实验显示,0.01,0.5和10.0mg/L添加水平的回收率均大于75%,且各添加水平重复测定8次的相对标准偏差均小于8%,说明所建立的间接竞争ELISA准确度高,重复性好,适合水中噻虫嗪残留的检测。     

酶联免疫法检测新型除草剂双甲胺草磷

以甲醇与三氯硫磷为原料,人工合成了半抗原结构类似物,与琥珀酸酣反应引入羧基,利用活性酯法使之与载体蛋白偶联,制得完全抗原,免疫动物获得多克隆抗体,建立了新型除草剂双甲胺草磷(H-9201)的间接竞争ELISA检测方法,并进行了水体中除草剂H-9201残留的实际样品检测.结果表明:所获得的多克隆抗体可以特异性的识别目标化...     

An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Determination of Dicyclanil in Animal Tissue

Dicyclanil is a toxic, pyrimidine-derived insect growth regulator used in veterinary medicine for the prevention of myiasis. A competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay was developed firstly for the determination of dicyclanil in animal tissue. The antigen was prepared using the glutaraldehyde method and polyclonal antibodies were obtained by immunizing rabbits with a dicyclanil-bovine serum albumin conjugate. The antibody obtained was specific for dicyclanil with an IC₅₀ of 9 ng/mL. Recoveries from sheep tissue and liquid milk were in the range of 52.5–72.4%, with coefficients of variation between 4.7% and 11.9%. The results were further confirmed by high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry.     

对克百威具高度特异性的免疫分析技术研究

合成了保留氨基甲酸酯结构的克百威半抗原,并采用活性酯法与载体蛋白质共价连接制备突出克百威分子结构特征的合成抗原。以合成抗原免疫新西兰白兔获得对克百威具高亲合力的抗血清,采用硫酸铵盐析和ＤＥＡＥ纤维素反相吸附法分离和纯化抗体。以辣根过氧化物酶采用改良的过碘酸钠法标记抗体、混合酸酐法标记半抗原。在此基础上分别建立了对克百威具高度特异性的间接竞争,包被抗原、包被抗体直接竞争酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）     

Detection of Aryloxyphenoxypropionate Herbicides by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

In this study, we developed a general and broad class-selective indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) for detecting aryloxyphenoxypropionate herbicides. A multideterminant artificial antigen was prepared from haptens of two herbicides (fenoxaprop-p-ethyl and cyhalofop-butyl) conjugated to the carrier protein Bovine serum albumin (BSA). The polyclonal antibodies (PAbs) were obtained by immunizing New Zealand white rabbits. Characterization studies of the PAbs showed that they had high affinity and specificity for the two herbicides. The 50% inhibitory concentration (IC₅₀) values for fenoxaprop-p-ethyl and cyhalofop-butyl were 0.185 mg L^?1 and 0.045 mg L^?1 with a limit of detection (LOD, IC₁₀) of 0.004 mg L^?1 and 0.002 mg L^?1, respectively. There were no obvious cross-reactivities with most of the aryloxyphenoxypropionates tested, except for metamifop (CR% = 55.56%). The recoveries of fenoxaprop-p-ethyl, cyhalofop-butyl and metamifop in environmental and agricultural samples (tap water, paddy water, soil, rice and soybean) ranged from 86.86–114.52%, 82.07–119.11% and 82.51–114.46%, respectively. These results demonstrate that the established ELISA could be used as a tool for detecting aryloxyphenoxypropionate multiresidues.     

食品中三唑酮的酶联免疫吸附分析

制备人血清白蛋白和三唑酮的结合物作为免疫原,免疫兔子获得了抗三唑酮的抗体,并建立了三唑酮的酶联免疫吸附分析法。此方法被成功的应用于黄瓜、梨等食品中三唑酮的分析,最低检出限为40ng/g样品,回收率为92.44％～98.18％。并与气相色谱分析结果有很好的一致性。     

孔雀石绿单克隆抗体制备和酶联免疫检测方法的建立

针对孔雀石绿三苯环特征结构,设计合成1种高质量半抗原。通过偶联载体蛋白、动物免疫和细胞融合,制备出一株高质量的单克隆抗体MG-DA4-C7,亚类为IgG1,轻链为κ型。通过对包被原浓度、抗体浓度、二抗浓度的优化,建立了孔雀石绿间接竞争酶联免疫分析方法。方法半抑制浓度( IC50)为0.96μg/L,线性检测范围(IC20~C80)为0.1~8.1μg/L,LOD(IC10)为0.05μg/L,回归方程y=-0.3274lgx+0.4698(R2=0.9891)。本方法特异性高,与代谢物隐孔雀石绿交叉反应小于0.1％,与结晶紫、灿烂绿交叉反应率分别为18.1％和26.5％;实际样品添加回收率为87.3％~107.3％。本方法测定结果经HPLC-MS/MS方法确证,二者相关系数达0.999。本方法可用于鱼类等水产品中孔雀石绿残留的实际检测。     

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Hyodeoxycholic Acid in Pharmaceutical Products Using a Monoclonal Antibody

Herein is reported an immunochemical approach to determine hyodeoxycholic acid using hybridoma-secreting monoclonal antibodies. The hyodeoxycholic acid-specific antibody was produced by fusing splenocytes immunized with a hyodeoxycholic acid-bovine serum albumin conjugate with a hypoxanthine–aminopterin–thymidine-sensitive mouse myeloma cell line (SP2/0). The antibody was highly specific for hyodeoxycholic acid, with less than 0.05 percent cross-reactivity to over fifty structurally related compounds. The antihyodeoxycholic acid monoclonal antibody was then used to develop a rapid, specific, and sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) for the determination of hyodeoxycholic acid in pharmaceutical compounds. The linear dynamic range was from 0.48 to 62.5 nanograms per milliliter with an IC₅₀ value of 8 nanograms per milliliter. The icELISA results correlated well with a conventional high-performance liquid chromatography method for the determination of hyodeoxycholic acid (R² = 0.9982). This study shows that the icELISA method was successfully applied to the quantification of hyodeoxycholic acid in pharmaceutical products.