癌变原理研究——Ⅸ.大鼠肝癌癌变过程中细胞增殖酶和组织特异酶基因表达的相互变化

以CPS_1,OCT,ACT cDNA克隆片段为探针与二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌癌变过程不同病变肝组织的poly(A)~+-RNA进行斑点杂交及Northern印迹杂交。结果表明:组织特异酶CPS_1,OCT mRNA量降低,而细胞增殖酶ACT mRNA量升高。这些mRNA量的变化都随病变程度而加深。CPS_1 mRNA分子略大于28S,OCT mRNA约为15S,ACT mRNA分子约为35S。癌变过程中CPS_1,OCT以及ACT mRNA量的相互变化与不同癌变肝组织酶活性的相互变化呈相关关系。     

CLONING OF cDNA CODING FOR CARBAMYL PHOSPHATE SYNTHETASE I AND CHANGES IN LEVELS OF CPS_1 mRNA DURING HEPATOCARCINOGENESIS

cDNA coding for carbamyl phosphate synthetase I was cloned from recombinant plasmid with insertcomplementary to the mRNA for CPS_1 followed by hybrid-selected translation screening. The length ofthe insert CPS_1 cDNA was approximately 800 base pairs. Using this cDNA as a probe, it was foundby dot-blot analysis of the total RNAs and poly(A)~+-RNAs isolated from rat livers with different path-ological lesions induced by diethylnitrosamine that the levels of CPS_1 mRNA were decreased, the de-crease being correlated with the malignancy of hepatocytes during carcinogenesis.     

乙型肝炎病毒表面抗原互补脱氧核糖核酸的分子克隆及检定

用特异性免疫沉淀法从一人肝癌细胞株(PLC/PRF/5)中浓集乙型肝炎表面抗原(HBsAg)信使核糖核酸(mRNA),制得互补脱氧核糖核酸(cDNA),进行克隆.用已克隆化的病毒探针进行原位杂交,检得一个含HBsAg cDNA的菌株.对它进行了限制性内切酶谱及核苦酸序列分析.该 HBsAg cDNA经~(32)P标记后与PLC/PRF/5细胞DNA和RNA分别进行分子杂交的结果,显示出整合入该宿主基因组中乙型肝炎病毒的拷贝至少有6个;含HBsAg特异序列的PNA有三种、本文对乙型肝炎病毒在原发性肝癌致癌基因中可能的作用进行了讨论。     

ALTERATION IN CHROMATIN CONFORMATION OF PROLIFERATING AND DIFFERENTIATING ENZYME GENES IN NORMAL MOUSE LIVER AND ASCITES HEPATOMA CELLS AND ITS RELATION TO THE GENE EXPRESSION OF ENZYMES

Nuclei from the normal mouse liver were partially digested with micrococcal nuclease, followed by DNA extraction, agarose gel clectrophoresis and dot blot hybridization with ~(32)P-labeled cDNA probes of CPS_1 and ACT complex, It was clearly shown that the CPS_1 genes were distributed on the monomer, dimer. and trimer of nucleosomes, while the genes coding for ACT complex were distributed on the condensed oligonucleosomes. An opposite manner of distribution of CPS_1 and ACT complex genes was, however, noted in the case of ascites hepatoma cells, in which the specific activity of ACT was 13 times higher than that in the normal liver, while that of CPS_1 was remarkably reduced. Similar patterns of change in mRNA level of CPS_1 and ACT complex were observed in the normal mouse liver and ascites hepatoma cells, indicating a close relationship between chromatin structure and gene expression of these enzymes.     

小鼠腹水肝癌细胞增殖酶及分化酶基因染色质构象的变化及其与酶基因表达的关系

小鼠腹水肝癌细胞的CPS_1活性较正常肝显著降低,而ACT活性则增高,约为正常肝的13倍。RNA-cDNA斑点杂交证明,肝癌中CPS_1mRNA很低,而ACTmRNA较正常肝增多。以微球菌核酸酶限制性消化正常肝及肝癌细胞核,琼脂糖凝胶电泳以及DNA-cDNA斑点杂交结果表明,在正常肝中,表达活跃的CPS_1基因分布在结构松散的单体、二聚体、三聚体核小体上,而表达较低的ACT基因则分布在比较致密的寡聚核小体上。腹水肝癌细胞的情况正好相反。CPS_1基因的表达很低,主要分布于寡聚核小体,而ACT基因的表达增高,主要分布于单体核小体。这些结果充分说明,肝癌细胞中分化酶CPS_1基因与增殖酶AST基因表达的相互变化与这两种基因核小体构象的相互变化有密切关系。     

人原发性肝癌中N-ras基因的表达

对9例人原发性肝癌,1例癌旁组织,1例正常肝的poly(A)~ RNA进行了分析。用各种癌基因探针作分子杂交,发现在6例原发性肝癌中,有二条增强表达的区带:2.2kb和5.6kb。肝癌组织较正常肝的mRNA在2.2kb处有明显的增强。提示人N-ras基因的转录产物明显增高。癌旁,正常肝中N-ras基因的专一的mRNA很弱或低于检测水平。由于癌的发生是通过癌基因产物发生作用,因此N-ras基因在多数的人原发性肝癌中的表达明显增强,提示了N-ras基因是人原发性肝癌的重要转化基因之一。     

苯乙酸对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖抑制作用及与RNA编辑酶ADAR1表达的相关性

为探讨苯乙酸(PA)对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖抑制作用及其与RNA编辑酶ADAR1表达的相关性, 应用细胞计数及MTT法检测了不同浓度(0.5, 1.0, 2.0和4.0 mmol/L)PA对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖抑制作用, 通过流式细胞术(FCM)分析了各细胞周期的细胞百分比, 应用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及免疫印迹杂交分析使用不同浓度(0.5, 1.0, 2.0 mmol/L)PA作用后肝癌细胞系SMMC-7721中RNA编辑酶ADAR1 mRNA及蛋白表达的变化. 结果表明, 肝癌细胞系SMMC-7721经不同浓度PA作用后, 增殖抑制率随作用时间延长及PA浓度增加而明显提高(P<0.05), 但2.0和4.0 mmol/L PA作用72 h后组间差异比较无统计学意义(P>0.05). 肝癌细胞系SMMC-7721中RNA编辑酶ADAR1 mRNA及蛋白表达随PA浓度增加而明显降低(P<0.05). 通过沉默SMMC-7721细胞中ADAR1的表达发现, ADAR1表达下调可有效抑制肝癌细胞增殖. 结果表明, PA可阻抑肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖, 且存在时间及剂量的依赖性, 作用机制与PA下调ADAR1表达相关.     

人原发性肝癌中的转甲状腺素蛋白(Transthyretin)基因

本文从人正常肝对原发性肝癌的递减式cDNA文库(Subtracting cDNA libra-ry)中筛选出pG8cDNA克隆.Northem杂交证明它在正常肝中高度转录,而在9例肝癌中转录严重受阻遏.9例肝癌DNA MspI酶切杂交信号提示,4例肝癌中该基因存在部分DNA片段的丢失.在另7对肝癌及癌旁组织样本中,有4例肝癌中该基因同样存在部分片段丢失.cDNA序列分析证明它与转甲状腺素蛋白(Transthyretin,TTR)基因的编码区全部同源.本文首次报道了在人肝癌中TTR基因转录严重受阻遏及在基因结构上可能存在丢失或缺陷,提示TTR基因可能是人肝癌中基因缺陷的一个标记或抗癌基因之一.     

基于RNA杂交的马铃薯纺锤块茎类病毒检测芯片

报道了一种检测植物类病毒RNA的新方法——RNA杂交芯片技术, 即将cDNA芯片技术与RNA斑点杂交技术相结合, 将马铃薯样品的总RNA直接固定在玻片上, 用荧光标记制备检测马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的特异探针, 探针与芯片杂交后分析杂交信号以确定相应的样品有无PSTVd侵染. 参照膜杂交的方法, 确定了RNA芯片的制备条件, 并用以检测了马铃薯样品的PSTVd侵染情况, 检测结果与RT-PCR结果相符, 阳性产物经克隆测序证实为PSTVd.     

冬小麦春化作用相关基因的cDNA分子克隆研究

以春化处理冬小麦幼苗cDNA为起始材料,通过与对照冬小麦幼苗mRNA进行减法杂交构建富集冬小麦低温诱导cDNA文库,以对照和脱春化幼苗cDNA及春化幼苗cDNA为探针,采用差异杂交技术筛选得到春化相关cDNA克隆,将插入片段用PCR方法扩增后亚克隆于pUC19载体的BamHⅠ和HindⅢ位点,用此插入cDNA作探针,与对照和春化组mRNA作Northern blotting分析表明为冬小麦春化作用相关基因的cDNA克隆,包含verc203序列的mRNA大约为2.6kb。     

甜菜黄脉坏死病毒RNA3和RNA4有生物活性体外转录产物及功能研究

甜菜黄脉坏死病毒RNA3和RNA4全长cDNA的合成是分别以Oligo-d(T)_(15)为引物合成第一链cDNA,cDNA的第二链的合成则分别应用RNA3和RNA4特异引物完成。全长双链cDNA分别克隆在pGEM3Zf(+)载体中,置于噬菌体Sp6启动子控制下。在体外以质粒DNA为模板应用“run off”系统及Sp6RNA Polymerase成功地合成了大量的具有高度生物活性的转录产物RNA3和RNA4。在两种转录反应系统中,以第一种方法即转录与加帽(capping)分步进行转录效率高,第二种方法(转录与加帽同时进行)转录效率较低,但转录产物侵染性更高。虽然在RNA3和RNA4转录产物的5′末端和3′末端分别含数目不同的非病毒核酸序列,但转录产物的活性并未受到显著的影响。应用这种具有高度生物活性的体外转录产物与该病毒Rg1分离物机械接种甜菜幼苗根毛,首次阐明了RNA3是导致甜菜丛根病的主要因素。     

野生大豆(Glycine soja SH1)球蛋白glycinin Gy4基因家族的两种表达拷贝

本文研究我国野生大豆(Glycine soja)种子贮藏蛋白基因的结构,并与栽培大豆进行比较,构建成野生大豆Glycine soja SH1和栽培大豆Glycine max子叶cDNA库。用已知含球蛋白glycinin Gy 4基因的克隆DNA λS 312为探针,从两个cDNA库中分离出6个克隆。其中两个克隆pWS 228与pWS 242含全长cDNA,克隆cDNA的限制酶图谱和cDNA与基因组DNA的Southern法杂交表明它们代表野生大豆球蛋白glycinin Gy 4基因家族的两种表达拷贝。pWS 228 cDNA的部分序列已测定并与栽培大豆相应顺序作比较。分子杂交还证明Ⅱ类glycinin基因家族的组编在野生大豆胚形成过程中的变动。     

转基因水稻植株再生及外源人α-干扰素cDNA的表达

本文使用转化脂介导转化法(Lipofectin-mediated transformation)成功地将含有人α-干扰素(Hu-α-IFN)cDNA以及与其连锁的新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)基因的E. coli质粒pIG3031导入到水稻(indica type rice)的原生质体内,并由此获得转化愈伤组织。基于Npt-Ⅱ酶活性的测定结果表明转化频率高达10％。筛选出的转化愈伤组织在分化培养基上再生出了完整的籼稻转基因植株。Southern杂交分析证明,外源Hu-α-IFN cDNA己整合到水稻基因组内;RNA条带杂交结果显示,外源Hu-α-IFN cDNA在T-DNA转录子1启动子(P1′)的控制下,在转化水稻细胞中有效地进行了转录;体外生物活性检测表明,转化植株组织抽提物中含有干扰素特有的抗病毒活性,说明外源Hu-α-IFN cDNA可在水稻细胞内正确表达。     

人肿瘤坏死因子(TNF)cDNA的分离、鉴定及其表达

PMA诱导的HL-60细胞株mRNA经逆转录合成cDNA;经过第一链cDNA为模板的PCR扩增反应,分离到一特异的615bp DNA片段。Southern杂交和DNA序列分析证实这一615bp片段包含了编码人TNF成熟肽所需的全部cDNA顺序。将这一人TNF cDNA克隆到大肠杆菌表达载体pKK223-3,获得人TNF直接表达质粒pHT-1。IPTG诱导的表达产物具有L-929细胞毒活性;并经抗体中和实验确证为人TNF。在A_(600)=2时,大肠杆菌产生的重组人TNF含量约为8×10~7U/1培养液。     

电化学石英晶体微天平实时表征和定量检测短序列DNA

利用电化学石英晶体微天平(EQCM)这一灵敏的质量和电化学传感器测定特定序列DNA。应用自组装膜技术在压电石英晶振表面自组装一带羧基的α－硫辛酸单层膜,通过盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价固化寡聚核苷酸为探针,用于测定与其碱基序列互补的DNA。实验中EQCM实时监测了α-硫辛酸的自组装过程、探针固化过程及其与cDNA杂交过程。定量得出了探针固化量及cDNA杂交量。在酸性、中性和碱性条件下,分别对固化和杂交过程进行表征,实验发现探针固化及DNA杂交都受pH影响,本文对此现象进行了解释。同时,利用染料Hoechst33258的电化学活性,使其与双链DNA嵌合,通过测量Hoechst33258的电化学信息进一步验证了DNA杂交关键步骤。     

大豆(Glycine max)贮藏蛋白两种编码顺序的克隆与性质

本文证明大豆(Glycine max)贮藏蛋白的两种编码顺序已经克隆。并通过分子杂交和体外翻译研究了它们的性质。其中一顺序与两种分子量不同的mRNA杂交,杂交选择mRNA在体外翻译成60kd和42kd多肽,推测为7S贮藏蛋白的α和β亚基,另一顺序则与分子量为0.7×10~6dalton的mRNA杂交,杂交选择mRNA在体外翻译成57kd和49kd多肽。     

应用mRNA/PCR技术研究中国人常见的一种β-地中海贫血基因(IVS-Ⅱnt.654 C→T)的剪接缺陷

应用扩增cDNA的直接序列测定,分析了中国人一种常见的β-地中海贫血突变类型(ⅣS-Ⅱ nt. 654 C→T)的转录产物和mRNA的剪接缺陷,结果表明这一突变基因除了导致β-珠蛋白m RNA的加工错误外,仍然产生少量正常剪接加工的mRNA。从而导致β~+地中海贫血。本文报道的方法为在转录水平上研究基因的表达,以及为遗传性疾病的分子缺陷提供简便和灵敏的新途径。     

基于illumina测序技术的IGROV-1/CP细胞中miRNA种类鉴定及相对丰度分析

从正常培养的IGROV-1/CP细胞中提取小RNA,构建小RNA的cDNA文库,然后用illumina通用测序平台对上述cDNA文库进行测序.从测序获得的序列数据中去除冗余数据后,与已知人类miRNA序列数据库进行比对,获得IGROV-1/CP细胞miRNA表达谱.以所获的序列长度与已知人类miRNA数据库中序列长度差异不大于2和无碱基错配为限制条件,共找到53种已知miRNA.按在cDNA文库测序中的出现频率计算,出现频率不大于10的低拷贝miRNA最多,占检测到所有miRNA种类的56.6%.说明illumina通用测序技术能够在检测细胞内的各种小RNA序列的同时反应相对丰度信息,该研究利用上述新技术获得了顺铂耐药性IGROV-1/CP细胞系miRNA表达种类和相对丰度的实验数据.     

miRNA在β_2受体激动剂作用中的研究进展

β_2受体激动剂的滥用威胁着消费者的人身安全,也制约着食品工业和畜牧业的发展,然而药物种类繁多,更新迅速,如何对其有效监测一直是研究的重点小分子RNA(miRNA)是近年来在真核生物体内发现的一类长度约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA,主要通过与靶基因mRNA靶标区域的互补配对,发挥降解靶mRNA或抑制mRNA翻译的作用。它能参与多种生物学过程包括细胞凋亡、分化和癌变等。β_2受体激动剂类药物有着共同的作用机理,近年来的研究表明,miRNA的异常表达与β_2受体激动剂的使用密切相关。本文主要对与β_2受体激动剂作用机理相关的miRNA的研究进展展开综述,以期为实现对该类药物的有效监测提供参考。     

人原发性肝癌及7402细胞株和髓细胞白血病细胞株(K562)的癌基因(转化基因)的共同属性——N-ras基因

用人的原发性肝癌(PHC)、肝癌7402细胞株(郭婵等,1984)及髓细胞白血病K562细胞株的DNA转染的NIH/3T3转化株DNA,以Southern吸印和~(32)P-标记的癌基因探针做分子杂交来分析,结果如下:在PHC DNA转化的NIH/3T3细胞DNA中,鉴定有N-ras基因的7.2及9.0kb(EcoRI酶切)的带,与人白细胞和肝癌DNA中出现的专一性条带相同,但是没有人Ha-ras(BamHI 6.6kb)或Ki-ras(EcoRI 3.0kb)的专一性条带。在以7402及K562细胞株DNA转化的细胞DNA中,同时发现有人的N-ras和Ha-ras基因(6.6kb,BamHI酶切),人的Ki-ras特异片段(3.0kb,EcoRI酶切)没有被检测到。PHC的DNA中N-ras基因在带型及杂交强度上没有大的改变,由于N-ras基因(非Ki-ras,Ha-ras)的表达,在多数PHC中明显地增加,提示了N-ras至少是人肝癌的转化基因之一。