油菜短花序突变体不同生育期内源激素含量的比较分析

用酶联免疫吸附技术(ELISA)测定了甘蓝型油菜(Brassica napus L.)短花序突变株系“M112”及其野生型亲本“112”在不同生育期茎尖内源生长素（IAA）和细胞分裂素（CKs）的含量.结果表明,在生长前期“M112”中CKs含量的增高促进了一次分枝的增多,在花期CKs含量增高刺激茎尖的IAA流向腋芽,从而阻碍花序的伸长.     

激素对甘蓝型油菜(Brassica napus L)矮化突变体幼苗生长及内源GA3含量的影响

以甘蓝型油菜矮化突变体“DDF-1”为材料,研究了赤霉素（GA3）、生长素（IAA）和油菜素内酯（BR）3种激素对突变体幼苗的影响,并用石蜡切片观察其细胞形态,用酶联免疫吸附技术(ELISA) 检测下胚轴内源激素GA3含量.结果表明,外加一定浓度的GA3（7 mg/L）对矮化突变体“DDF-1”的下胚轴伸长作用显著,但不能使之恢复到野生型的长度;萌发早期,BR有明显的促进伸长作用,萌发后期效果不明显;突变体对IAA敏感性较弱.三种激素交互作用对矮秆下胚轴伸长的影响也不显著.施加外源GA3的矮化突变体“DD     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

拟南芥叶色突变体ems3的基因定位

ems3是经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变筛选得到的一拟南芥叶色突变体.通过背景纯化与遗传分析,发现ems3突变体是单基因隐性控制.利用图位克隆的方法对叶色基因EMS3进行了定位,结果表明:EMS3位于第5条染色体分子标记MHF15和MHF152之间55kb的区间内.生物信息预测,该区间包括有16个基因.这些结果为该基因的克隆及叶绿体发育过程中的功能研究奠定了基础.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

稻瘟菌REMI突变体库的构建

以稻瘟病菌菌株P131和Y34为材料，利用REMI技术构建了含有8000个转化体的突变体库．对REMI转化的部分条件进行了优化，比较了不同限制性内切酶(XhoI、ApaI和EcoRV)之间REMI转化效率的差异．结果表明，稻瘟菌分生孢子在摇培32h和Drisdase消化菌丝2h或3h时较适宜REMI转化；XhoI和ApaI之间没有明显差异，而两者的转化率高于EcoRV．     

甘蓝型油菜矮秆突变基因ndf1的分子标记连锁遗传作图

利用240对SSR和672对SRAP分子标记, 以甘蓝型油菜矮秆突变株系与高秆野生型杂交的回交一代(BC1)群体为材料, 对甘蓝型油菜矮秆突变基因ndf〖STBX〗1〖STBZ〗进行连锁遗传作图分析. 结果表明 : (1)在240对SSR引物中, 有145对的扩增产物显示出突变株系与野生型间具有多态性, 采用矮秆与高秆杂交F2群体集团分离分析法(BSA)筛选连锁分子标记, 并利用BC1群体进行遗传连锁作图分析, 发现位于13号连锁群上的Na12 E02和CB10057〓2对SSR标记与矮秆突变基因ndf〖STBX〗1〖STBZ〗位点紧密连锁, 2对标记位于矮秆突变基因ndf〖STBX〗1〖STBZ〗的同侧, 连锁图距分别为634cM、877cM; (2)经过672对SRAP分子标记连锁遗传分析, 获得了4对与矮秆突变位点连锁的SRAP标记: Me15em4 288、Me28em3 171、Me25em15 262和Me3em18 684, 与矮秆突变位点的连锁图距分别为1248cM、1519cM、2019cM和3546cM, Me28em3 171和Me3em18 684位于矮秆突变基因ndf〖STBX〗1〖STBZ〗的另一侧.     

水稻“9311”突变体库的氯酸盐毒性筛选与分析

【目的】用氯酸盐筛选水稻(Oryza sativa)突变体库,分析氯酸盐对水稻的毒性。【方法】使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulphonate,EMS)处理水稻材料“9311”种子,构建完成了水稻“9311”突变体库。【结果】通过水培法并利用氯酸盐的特性对诱变材料进行筛选,共筛选了2 361份诱变M2代材料,且与野生型相比获得了40份对氯酸盐表现差异敏感的材料。【结论】研究结果为进一步的材料创建与相关基因克隆提供了基础,也为水稻硝酸盐吸收与转化相关分子机理的研究奠定了基础。     

激素对油菜子叶再生及转基因瞬间表达的影响

以甘蓝型油菜“湘油15”子叶为外植体,以MS为基本培养基,采用正交试验设计,研究了预培养基2,4-D和6-BA浓度、分化/共培养基NAA和6-BA浓度对子叶芽再生频率和转GUS基因瞬间表达率的影响.结果表明,激素对芽再生频率和转基因瞬间表达率都有重要影响,但激素对芽再生和转基因瞬间表达的影响效应具有不一致性.激素对芽分化的影响程度从大到小依次为再生培养基NAA、预培养基6-BA、预培养基2,4-D、再生培养基6-BA,推导的对于芽再生的最佳激素组合方案为预培养基2,4-D 1.0 mg/L和6-BA1.0 mg/L、再生分化培养基NAA0.2 mg/L和6-BA3.0 mg/L;激素对GUS基因瞬间表达的影响程度从大到小依次为共培养基NAA、共培养基6-BA、预培养基6-BA、预培养基2,4-D,推导的对于瞬间表达的最佳激素组合方案为预培养基2,4-D 0mg/L和6-BA0.2 mg/L,共培养基NAA0.05 mg/L和6-BA3.0 mg/L.推导的对于芽再生频率×GUS基因瞬间表达率的最佳激素组合方案为预培养基2,4-D 1.0 mg/L和6-BA1.0 mg/L,共/分化培养基NAA0.05 mg/L和6-BA3.0 mg/L.     

斑马鱼cGnRH-Ⅱ的基因克隆与序列分析

从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT--PCR方法克隆eGnRH cDNA,其长度为646bp,包括一个258bp开放阅读框;编码的cGnRH-Ⅱ前体为86个氨基酸残基,由一个信号肽、GnRH十肽和一个由蛋白水解位点（Gly—Lys—Arg）连接的促性腺激素释放激素相关肽（GAP）组成;其中信号肽和联接肽的长度分别为24和49个氨基酸．该eDNA编码的cGnRH-Ⅱ的前体氨基酸序列与其他物种的cGnRH-Ⅱ前体一致．表明物种问cGnRH—Ⅱ cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低．进化分析表明,斑马鱼与鲤鱼、鲫鱼、拟鲤、黑头软口鲦等淡水的鲤科鱼类的同源性较高．     

甘蓝型油菜突变体Cr3529抑制性消减文库的构建

应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建了甘蓝型幼叶黄化油菜突变体Cr3529和其野生型3529品系幼叶期的正、反向消减文库．经茵落PCR检测，正向消减文库的有效重组率为55．5％；反向消减文库的有效重组率为76．5％．为进一步克隆消减文库中的差异表达基因和研究这些基因的功能奠定了基础．     

油菜内生真菌的分离鉴定

本试验通过对健康油菜组织表面消毒、内生真菌的分离培养和鉴定,获得以下结果共获得内生真菌45种, 其中子囊菌1种,半知菌43种(丝孢纲40种,腔孢纲3种),担子菌1种,分离物中37个种分属于20个不同属,8个种归属待定.从分离几率来看,没有明显优势的种类存在,在叶部分出率最高的是Alternaria alternata, 分离几率仅为7.04%.不同油菜器官的内生真菌种类有一定的差异,从叶部分离出25种,根部分离出12种、花器11种、茎12种、幼苗2种.以上结果显示油菜内生真菌复杂、具有丰富的种类多样性.     

堆肥未培养细菌的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆和鉴定

从自制堆肥样品中提取未培养细菌的总DNA,用柯斯质粒pW EB∷TNC为载体构建宏基因组文库,对文库进行筛选获得表达木聚糖酶活性的克隆,再进行亚克隆、测序分析以及B lastx搜索G enB ank分析木聚糖酶基因。结果构建得到一个包含约5万个克隆的宏基因组文库,文库中外源DNA总容量约为1.8×106kb,获得2个表达木聚糖酶活性的克隆:pGXN 1050和pGXN 1051,鉴定分析表明:pGXN 1050上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11A具1个771bp的ORF(Open R ead ing F ram e),可编码含257个氨基酸的蛋白质,所编码产物与混合纤维弧菌(C ellv ibr io m ix tus)的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有46%的一致性和57%的相似性;pGXN 1051上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11B具一个723bp的ORF,可编码含241个氨基酸的蛋白质,编码产物与混合纤维弧菌的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有73%的一致性和80%的相似性。木聚糖酶Um xyn11A和Um xyn11B都属于糖基水解酶家族11的成员。     

甘蓝型油菜独脚金内酯相关基因的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一类新鉴定的植物激素,参与抑制茎分枝.采用同源克隆技术自甘蓝型油菜中得到了三个SLs相关基因,分别命名为BnMAX4,BnMAX1和BnD14,其CDS各长1707,1593,804bp,推测编码的蛋白质功能分别为β-类胡萝卜素加氧酶,细胞色素P450,α/β水解酶.RT-qPCR表达分析显示在野生型甘蓝型油菜二叶及四叶一心期的各组织器官中,BnMAX4主要在二叶一心期的根中表达;BnMAX1无明显表达优势组织;BnD14在二叶一心期的叶中高表达.旱胁迫及盐胁迫处理时BnMAX4的表达趋势为骤降;BnMAX1旱胁迫处理时表达量降低,盐胁迫处理时先下降后上升,9h后又下降;BnD14旱胁迫处理时在3h与12h各有两个表达高点,盐胁迫处理时在3h表达量最高.     

甘蓝型油菜种皮黄酮类色素种类的研究

用纸色谱结合紫外光谱分析，对甘蓝型油菜种皮中黄酮类色素进行了分离及种类鉴定，发现甘蓝型黑、黄籽油菜种皮中均含有花色素、大量黄酮醇、少量的异黄酮苷及黄酮醇苷。不同之处在于，黑籽中除含有上属成份外还含有大量黄酮，而黄籽中含有大量异黄酮类色素．     

甘蓝型黄籽油菜育种研究进展

介绍了国内外甘蓝型黄籽油菜育种的理论及方法,概述近年来取得的成果,指明今后研究的重点和方向,并指出黄籽育种必须与生物技术相结合,才能适应育种科技发展的需要     

海甘蓝硫甙合成关键酶S—GT基因两种表达载体的构建

Thiohydroximate S-glucosyltransferase(S-GT)是硫甙生物合成的一个关键酶.根据发表的甘蓝型油菜S-GT基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长,构建了海甘蓝S-GT基因的植物双元表达载体pCambia2300sn-CaSGT.用PCR的方法对CaSGT基因的外显子进行了拼接,将得到的序列正向插入到了大肠杆菌表达载体pET-32b(+)中,得到重组质粒pET·32b(+)-CaS-GT,为进一步研究CaSGT的生物学特性打下基础.     

海甘蓝硫甙合成关键酶S-GT基因克隆及种子特异性hpRNAi载体构建

根据甘蓝型油菜S-GT(thiohydroximate S-glucosyltransferase)基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增.获得S-GT基因全长.克隆的海甘蓝S-GT序列与甘蓝型油菜序列相比,除74 bp的内含子部分外有92个碱基的差别,相似性高达93.4%.分析显示该序列均有完整的开放阅读框,并表明所克隆的海甘蓝S-GT序列编码465个氨基酸,在第10个位点上比甘蓝型油菜序列少一个丙氨酸(A),总共有23个氨基酸不同,相似性为95.06%.根据获得的基因序列设计引物扩增出同一基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到已构建的带有种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了海甘蓝S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体,为特异性降低海甘蓝的种子硫甙奠定了基础.     

海甘蓝硫甙合成关键酶S—GT基因克隆及种子特异性hpRNAi载体构建

根据甘蓝型油菜S-GT（thiohydroximate S-glucosyltransferase）基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长。克隆的海甘蓝S—GT序列与甘蓝型油菜序列相比,除74bp的内含予部分外有92个碱基的差别,相似性高达93．4％。分析显示该序列均有完整的开放阅读框,并表明所克隆的海甘蓝S-GT序列编码465个氨基酸,在第10个位点上比甘蓝型油菜序列少一个丙氨酸（A）,总共有23个氨基酸不同,相似性为95．06％。根据获得的基因序列设计引物扩增出同一基因序列相同但是带有不同酶切位点的两个片段,将两个片段反向插入到已构建的带有种子特异表达载体内含子的两端,成功构建了海甘蓝S-GT基因的种子特异性hpRNAi载体,为特异性降低海甘蓝的种子硫甙奠定了基础。     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。