新疆加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现花叶、畸形以及坏死症状的加工番茄病株上获得黄瓜花叶病毒分离物，用1对CMV CP基因引物进行RT-PCR，扩增得到了776bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体PUCm-T中转化大肠杆菌DHSa。经限制酶酶切鉴定，重组克隆中含有与PCR产物大小相同的776bp的插入片段。cDNA全序列分析表明，重组克隆含1个开放阅读框架（ORF），长度为657nt，编码218个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的核苷酸同源性高达91．0％-98．9％．而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在76．4％-78．2％，所测得的CMV新疆分离物与CMV亚组Ⅰ的氨基酸同源性高达94．2％-98．6％；而与CMV亚组Ⅱ的核苷酸同源性仅在79．9％～83．5％．CMV亚组Ⅰ的株系较CMV亚组Ⅱ株系同源关系更密切，所以CMV新疆分离物应该归属于CMV亚组Ⅰ。     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因的克隆研究

玉米(Zea mays L.)矮花叶病在国内外广泛发生,且在玉米生产中造成了重大损失.通过RT-PCR法从具有典型的玉米矮花叶病症状的玉米叶片中克隆了外壳蛋白(Coat protein,CP)基因,测序和同源性比较表明所克隆的CP基因来自玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)B株系,全长920个碱基对,开放阅读框编码219个氨基酸,该基因可进一步用于玉米抗矮花叶病的转基因研究,以获得生产应用的抗病材料.     

大豆花叶病毒Sc株系外壳蛋白基因的部分序列分析

采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术,体外扩增ＳＭＶ－Ｓｃ株系的外壳蛋白基因并进行部分测序。结果表明：所测５＇端１５０个核苷酸序列同已发表的ＳＭＶ－ＢＪ（北京分离物）、Ｓａ株系同源率分别为９５％和９３％,３＇端非编码区同ＢＪ株系同源率为８４％。     

烟草花叶病毒两株系的生物学和寄主病生理的比较研究

利用烟草花叶病毒普通株系（ＴＭＶ－ｏｍ）和来自新疆辣椒上的ＴＭＶ黄白卷叶株系（ＴＭＶ－ｗｙｒ）进行了比较研究。结果表明：两株系除引起辣椒和三生烟症状不同外,亦导致其他性状上的差异。ＴＭＶ－ｗｙｒ的致死温度为６０～７０℃,稀释限点１０－４～１０－５;辣椒病组织中产生大量病毒粒子的聚集体、网膜结构和分散的病毒粒子,叶绿体呈筒状;粒体大小为２５８×１６ｎｍ,ＴＭＶ－ｏｍ在辣椒病组织中只形成病毒粒子聚集体,叶绿体呈球状。辣椒酶谱分析表明：ＴＭＶ－ｏｍ接种株ＰＯＤ同工酶的活性（３条深色带）显著大于ＴＭＶ－ｗｙｒ接种株（１条深色带）。由此我们认为这些生物学性质和病生理差异可作为区分ＴＭＶ－ｗｙｒ和ＴＭＶ－ｏｍ的诊断指标。     

侵染新疆辣椒CMV的外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从表现黄化的辣椒病株上获得分离物XJ-P,用1对CMV基因引物进行RT-PCR,扩增得到了774bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物克隆到pMD18-T载体中再转化到大肠杆菌TOP10。经限制性内切酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR产物大小相同的774bp的插入片段。cDNA全序列分析表明,所扩增出的774bpCMV基因,含1个657bp开放阅读框架（ORF）,编码218个氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的CMVCP基因。所测得的XJ-P分离物其CP基因与CMV亚组Ⅰ、亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源性分别为90.84%-94.22%和74.37%-76.52%,氨基酸同源性分别为94.04%-98.17%和80.37%-82.19%,因此将该分离物鉴定为黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ。     

芜菁花叶病毒四川分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

从四川省3个蔬菜基地感病的甘蓝、花菜、萝卜、叶芥菜分离到芜菁花叶病毒6个分离物.利用 RT-PCR克隆了这6个分离物的外壳蛋白基因(CP), 测定了它们的核苷酸序列并进行了序列分析. 结果表明,6个分离物的 CP基因均为864个碱基,核苷酸序列同源性较高, 达 97.0%～100%;它们与 world-B组分离物的同源性最高,达 92.1%～100%;与 basal-B组分离物的同源性最低,仅 87.6%～90.2%. 基于 TuMV的 CP基因核苷酸序列的分子进化树显示,TuMV分离物可分为4组,本研究所分离到的6个 TuMV四川分离物属于第四组,即 world-B组.     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

黄瓜花叶病毒新疆株的桃蚜传播特性

研究了桃蚜传播黄瓜花叶病毒新疆株(CMV-XJ)的规律,结果表明：无毒蚜虫能够获毒的最短取食时间为30 s,获毒率随取食时间的延长而提高,取食时间为70 s以上时,获毒率达100%;带毒蚜虫传毒的最短取食时间为0.25 h,当取食时间超过最短传毒时间时,传毒率随取食时间的增加而升高,取食时间达2 h以上时,传毒率达100%;带毒蚜虫能够传毒的最少头数为1头,传毒率随单株植物带毒蚜虫数目的增加而升高,单株虫量达15头以上时,传毒率达100%.说明桃蚜可以高效率地传播黄瓜花叶病毒新疆株.     

2株黄瓜花叶病毒卫星RNA的cDNA克隆及序列分析

在辣椒上获得2株黄瓜花叶病毒卫星RNA(CS1和CS2),通过cDNA克隆和测序并将其与35个已知的卫星RNA序列进行同源比较．结果表明,CS1和CS2的全长序列分别为336,382nt;与CS2、Rs和Yns比较,CS1从第80位起有连续30多个核苷酸的缺失．由此推测,卫星RNA的二级结构也随这些核苷酸的缺失而发生了改变．将CMV卫星RNA分为4个组,卫星RNA CS1属于中小卫星组小卫星亚组Ⅱ,CS2属于长卫星组,CS1与其他来源的卫星RNA的同源性为80．4％～93．7％,CS2与其他来源的卫星RNA的同源性则为75％～94．8％;两之间的序列同源性为86％．CMV卫星RNA的序列同源性和分组与卫星RNA分布的地区和寄主来源并无直接联系．     

PRV外壳蛋白基因转化番木瓜的研究

利用番木瓜亲本材料76号的成熟再生系统,以胚性愈作国组织作为转化材料,与农杆菌LBA 4404共培养后得到抗卡那霉素的再生植株,经PCR,Southern blot检测,证明PRV CP基因已整合进番木瓜基因组。     

黄瓜花叶病毒的侵染扩散及病变细胞的电镜观察

在电镜下观察黄瓜黄叶病毒的侵染扩散部位发现：病毒粒体入侵细胞及复掣一子 体的扩散同烟草花叶病毒一样是以整体形式向细胞壁靠拢，附着，并通过胞间连丝进入易感细胞，同时还发现少量病毒粒体似有直接穿过胞壁入胞的现象。     

甘薯羽状斑驳病毒中国分离株外壳蛋白基因的克隆和序列分析

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,以我们从国内甘薯品种徐薯-18上分离到的SPFMV的RNA为模板,经过反转录合成cDNA第一条链,经PCR扩增、限制性酶切后克隆于pUC19的Hind 和SacI位点,转化大肠杆菌JM109,经限制性酶切分析、PCR鉴定以及序列分析证实获得了SPFMV中国分离株外壳蛋白基因的全长克隆.     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP，MP基因的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段，经过Sal I和Rst I酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒相互作用的寄主因子、克隆寄主因子，推测其种类和功能打下基础。     

甜菜坏死黄脉病毒不同分离物外壳蛋白的研究

应用SDS-PAGE和PCR—SSCP分析技术，对新疆不同地区的BNYVV分离物进行分析，结果表明：12个分离物蛋白质外壳的蛋白亚基分子量均为20kD；来自库尔勒的K4和K5分离物编码外壳蛋白质的基因不同于其他地区和本地区的分离物，二者彼此间也不相同。     

转CMV-CP基因的番茄对CMV的抗性表现及遗传分析

本实验表明转CMV-CP(Cucumber Mosaic Virus Coat Protein)基因的番茄对CMV的侵染有很强的抗性。外源基因在转基因番茄及其后代中的分离比例为3:1和1:1。