人泡沫逆转录病毒介导的siRNA抑制HBV基因表达与复制

本研究采用基于PCR技术的siRNA表达方法,快速筛选到两个可以抑制HBV基因表达的siRNAs序列:S2和X1.S2和X1被克隆到人泡沫逆转录病毒(human foamy virus,HFV)载体中,构建成为分别表达S2和X1的单表达载体和同时表达S2和X1的双表达载体.将siRNAs表达载体转导入HepAD38细胞系中,多种检测分析的结果表明这些siRNA表达载体可以有效抑制多个HBV基因的表达和病毒DNA复制;并且其抑制作用是长期的,可以持续到转导后3个月.     

HBV X蛋白与宿主APOBEC3G蛋白之间的相互作用

将原核重组质粒双酶切后释放的χ基因与真核表达载体连接，构建真核重组质粒pcDNA3.1-X，然后与真核重组质粒pcDNA3.1-APOBEC3G共转染HepG2细胞，提取蛋白进行免疫共沉淀并用Western blot分析结果。免疫共沉淀后，HA-APOBEC3G融合蛋白能够在抗HBx的免疫沉淀物中检测出来，在抗HA标签的免疫沉淀物中也能检测到HBx。揭示了这两种蛋白能在受体细胞内形成复合物。结果表明乙肝病毒X蛋白与APOBEC3G蛋白在细胞内能发生相互作用，提示APOBEC3G抗HBV作用可能与乙肝病毒X蛋白有关。     

HCVNS2基因表达载体的构建及在E.coli中表达

PCR人含有丙肝病毒全长非结构蛋白的载体pBlueBac25中扩增出全长的NS2基因DNA片段,分别克隆到表达载体pQE30和转座载体pFasBacHTb的多隆位点（MCS）,PFastNS2通过转座插入穿梭载体Bacmid的表达盒;pQENS2转化JM109菌株,诱导表达出N端含有6个His的全长His的全长NS2蛋白,用Ni-NTA-agarose柱层纯化,获得提纯的全长NS2蛋白。     

在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）．利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ＰＥＸ．ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表达具有明显的抑制作用，从而为在真核水平上利用反义ＲＮＡ对Ｘ基因进行调控的研究提供了有利的基础．     

类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达

根据大肠杆菌密码子偏好性,优化人胰岛素原基因序列,同时用2个赖氨酸取代C链。重叠PCR扩增法克隆优化的类人胰岛素原基因,PCR扩增引物中引入胰蛋白酶酶切位点和核酸限制性内切酶识别位点。经酶切、拼接获得类人胰岛素原多拷贝基因,并构建人胰岛素原基因多拷贝原核表达载体,转化感受态大肠杆菌诱导表达融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳,考马斯亮兰染色和融合蛋白染色条带光密度分析表明,含有4拷贝的类人胰岛素原重复基因序列原核表达载体的诱导表达类人胰岛素原效率最高,是单拷贝类人胰岛素基因原核表达载体表达效率的3倍左右。表达产物经质谱鉴定,确定为优化设计的类人胰岛素原,表明构建的多拷贝类人胰岛素原基因表达载体可应用于后续人胰岛素原的高效表达生产研究。     

温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８,构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５,该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签,利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ 基因的１１４８１８５７ 编码序列分别插入到ｐ Ｖ Ｖ５ｂ、ｐ Ｅ Ｔ２８ｂ 的相应位点,构建了重组表达质粒 ｐ Ｅ Ｇ１ｂ、ｐ Ｂ Ｇ７ｂ,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的 ４２％ 和２８％ 表达产物为融合蛋白并主要以包涵体的形式存在 该蛋白 Ｎ 端与含６ 个组氨酸在内的３０ 个氨基酸残基的多肽相连,利用 Ｉ Ｍ Ａ Ｃ金属螯和层析柱,对包涵体中的重组ｐ２４ 蛋白进行纯化, 其纯度超过 ８０％ ;对上清中的可溶性ｐ２４ 蛋白进行纯化,产物最终纯度超过６７％ 纯化后的重组蛋白可与 Ｈ Ｉ Ｖ１ 型标准阳性血清发生较强的免疫学反应     

ω~3-脂肪酸脱氢酶基因启动子表达载体的构建与转化

为了研究拟南芥ω3-脂肪酸脱氢酶基因启动子的表达特性,利用PCR扩增获得拟南芥ω3-脂肪酸脱氢酶基因的启动子(FAD8P),构建植物表达载体并转化拟南芥.转基因拟南芥种子经Kan筛选获得阳性植株,然后12°低温处理并进行GUS染色.GUS染色表明FAD8P于12°处理54h后可表达.本实验结果为ω3-脂肪酸脱氢酶基因功能的进一步研究奠定了基础.     

大豆种子形态建成期与成熟期正反抑制消减文库构建及差异表达基因分析

为了分析大豆种子形态建成期与成熟期基因差异表达情况,获得在发育过程中可能影响大豆种子形态建成及蛋白质、油脂合成代谢等调控的重要基因,利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了高含油量大豆品种中豆32开花后15天胚和36天胚正反消减文库.从正反消减文库中挑取克隆,经PCR及点杂交筛选后,从15天胚消减库(正向)和36天胚消减库(反向)中分别挑选了476个和471个有效克隆测序, 经BLAST比对归并后,根据测序结果设计基因特异引物,通过半定量PCR和荧光定量PCR检测了13个差异表达基因,其中正向库5个,反向库8个.对这些差异表达基因的组织特异性检测表明,仅发现4-662(蔗糖结合蛋白基因)在胚中特异表达.对这些基因在大豆种子发育过程中的作用进行了讨论.     

咸宁市饮食从业人员乙型肝炎检测结果的分析

以饮食从业人员为检测对象.每人静脉采血5 mL,分离血清,应用ELISA方法进行检测.共检1 640人,HBsAg阳性96人,阳性率为5.85%(96/1640),其中HBsAg阳性血清进一步做HBeAg、抗-HBe、抗-HBc检测,阳性率分别为7.29%(7/96)、67.7%(65/96)、91.6%(88/96).其中男性722人,阳性62名,阳性率为8.59%(62/722),女性918人,阳性34名,阳性率为3.70%.HBsAg阳性率5.85%低于全国平均水平的8.08%.男性阳性率8.59%略低于我国1992年调查的11.3%,女性阳性率3.70%则明显低于我国同期调查的女性HBsAg阳性率8.23%.     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.     

HEV嵌合抗原的克隆表达及在抗-HEV ELISA试剂中的应用

通过反转录从戊肝病人粪便中克隆了戊型肝炎病毒（HEV）第二（ORF2）和第三（ORF3）读码框区的抗原决定簇基因，利用基因工程手段，在大肠杆菌中表达了含有上述二种抗原的融合蛋白，该融合蛋白具有良好的抗原性和特异性，以该融合蛋白为抗原制备的抗－HEV ELISA试剂检测中国药品生物制品检定所40份标准血清时，其阴性、阳性符合率分别达29／30、10／10，符合国家标准。     

RNA药物抗乙型肝炎病毒的研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)导致的慢性感染已经成为威胁全球健康的主要问题之一.传统的抗乙肝药物如以拉米夫定和阿德福韦为代表的核苷类似物以及干扰素类药物在临床上都存在一定的局限性,因此寻找新的抗乙肝药物已经成为当务之急.本文主要从小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和配体指数富集的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选的RNA适配子这3个方面来分别阐述用小分子RNA药物抗HBV的研究进展和展望.     

p16蛋白对B型流感病毒诱导HeLa细胞凋亡的影响

以流感病毒 B/沪防 93- 1株感染 He L a细胞 ,通过 Hoechst332 5 8荧光染色、琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡 ,并用免疫组化技术测定 p16蛋白的表达 ,探讨 p16蛋白表达对 He L a细胞凋亡的影响 .结果表明 ,B型流感病毒感染 He L a细胞可诱导其凋亡 ,感染 2 4h后 ,细胞凋亡数达 84.5 % ;He L a细胞凋亡伴随 p16蛋白的表达 ,2 4h达高峰 ,阳性率为 49.2 3± 1.70 .研究结果提示 ,B型流感病毒感染诱导 He L a细胞凋亡过程与 p16基因激活相关 ,p16蛋白可能是介导流感病毒诱导细胞凋亡的另一重要途径 .     

正链RNA病毒基因组感染性克隆研究进展

综合叙述了构建正链RNA病毒基因组全长感染性cDNA克隆的基本思路和关键技术，并总结了影响基因且全长克隆感染性的因素，还简要介绍了利用正链RNA病毒基因组感染性克隆所得的一些研究进展，概括了目前内在该方面的研究现状。     

罗氏沼虾幼苗体内一种极小病毒的序列测定与分析

从患罗氏沼虾幼苗肌肉白浊病的幼虾体内分离到两种病毒颗粒,诺达病毒(MrNV)和直径只有15nm的小病毒颗粒(extrasmallvirus,XSV),本文通过建立病毒cDNA文库获得XSV基因组的部分序列,在此基础上合成探针,用从病虾组织中提取的总PNA进行Northern杂交,结果表明XSV基因组至少包括两条RNA片段.利用不同的方法对XSV的两端序列进行克隆和测定,分别得到了872、831和662bp3个相互重叠的序列片段,这3个序列的阅读框编码一个相同的大小在17×103左右的蛋白.     

表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建

将以PRVgG为启动子，SV40plyA为加尾信号的CSFV E2表达盒克隆于包含伪狂犬病病毒（PRV）tk基因和gH基因片段的重组质粒pTK2.5,替换掉tk基因的SalⅠ与XhoⅠ酶切位点之间的序列，构建了携带CSF E2基因的转移载体pTKE2。免疫荧光检测证实，转染BHK21细胞pTKE2在感染PRV的情况下，能表达E2蛋白，采用特异性引物PCR方法扩增gfp表达盒，对酶切位点进行改造，将其克隆到pTKE2的SalⅠ位点，构建了利用PRV gG启动子和HCMV IE启动子分别控制E2基因和gfp基因表达，两基因取向相反的双基因转移载体pTKE2.EFP.将双基因转移载体pTKE2.GFP转染BHK21细胞中，12h后在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的GFP表达，表达的GFP不引起细胞毒性。     

蛙虹彩病毒cop基因的克隆表达及亚细胞定位

从蛙虹彩病毒(Rana gryliovirus,RGV)基因组中克隆了含凋亡相关结构域的新基因-cop(Caspaserecruit ment domain only protein,COP)基因的全部编码区,成功构建了重组表达载体,进行了原核表达,并在鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosumcyprini,EPC)中进行了亚细胞定位.序列分析表明,RGVcop基因全长288 bp,编码一个长为95 aa,分子量为10.4×103的推定蛋白.二级结构预测表明其含有5个α螺旋.同源性比对分析显示,RGVcop与其他6株虹彩病毒及人类cop相关蛋白同源性最高为94%,最低为33%.重组原核表达质粒pET28a-COP转化大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达,获得一条约14×103的融合蛋白.重组真核表达质粒pEGFPN3-COP转染EPC细胞,经DAPI染色后,在荧光显微镜下观察显示重组蛋白在整个细胞中均有分布.