基于氧化单壁碳纳米角的荧光适配体传感器对胰岛素的检测

构建了一种基于氧化单壁碳纳米角(oxSWCNHs)荧光适配体传感器用于胰岛素的检测。合成了水溶性的单壁碳纳米角和羧基荧光素(FAM)标记的胰岛素适配体,该适配体能与胰岛素进行高亲和力和强特异性的结合。当体系中没有胰岛素存在时,FAM标记的适配体可以被oxSWCNHs吸附,致使体系具有较低的荧光强度;当体系中有胰岛素存在时,胰岛素可以与其适配体进行强特异性结合,导致FAM标记的适配体远离oxSWCNHs表面,FAM荧光不能被oxSWCNHs淬灭,体系具有较强的荧光强度,实现荧光强度的增强。研究了淬灭剂的用量、反应时间的影响,同时进行了选择性、干扰实验和实际样品分析等。该传感器的线性范围为0～1.6 nmol/L,检出限为0.1 nmol/L,可用于小鼠血清中胰岛素的测定。     

基于碳纳米颗粒的荧光适配体传感器用于腺苷脱氨酶的检测

设计了一段羧基荧光素(FAM)标记的适配体,该适配体能与腺苷进行高亲和力和强特异性的结合,而不与肌苷发生作用。腺苷脱氨酶可以与腺苷发生脱氨反应,生成肌苷。基于上述原理,构建了碳纳米颗粒-适配体-腺苷荧光适配体传感器用于腺苷脱氨酶的检测。当体系中没有腺苷脱氨酶时,FAM标记的适配体与腺苷紧密结合,而不能被碳纳米颗粒吸附,体系荧光较强;当体系中存在腺苷脱氨酶时,腺苷变成肌苷,肌苷不与适配体结合,此时FAM标记的适配体被碳纳米颗粒吸附,FAM荧光淬灭,体系具有较低的荧光强度。该方法简单、灵敏,线性范围为0.25～3.125 U/mL,检出限为0.18 U/mL。与其它蛋白分子相比,方法对腺苷脱氨酶的检测具有高特异性。构建的传感器简单,再生性好,可用于标准加入法检测小鼠血清中的腺苷脱氨酶。     

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50～100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。     

基于非标记适配体结构变化荧光法检测黄曲霉毒素B1

构建了一种基于非标记适配体结构变化荧光检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的方法。无AFB1时,一条非标记的AFB1适配体同时与2条短互补DNA链杂交,形成DNA双链结构,导致标记于其中一条互补DNA的3’端的荧光素（FAM）与标记于另一条互补DNA的5’端的淬灭剂（BHQ1）相邻近,发生荧光共振能量转移,FAM荧光被BHQ1淬灭。AFB1存在时,适配体与AFB1结合,而不与互补DNA发生杂交。此时,FAM与BHQ1距离较远,FAM荧光不能被淬灭。通过测量体系荧光强度变化可定量检测AFB1。方法检出限0.2 nmol/L,定量检测范围1.0 nmol/L～4.0μmol/L。该方法无需共价标记适配体,操作简便,特异性好,能够用于检测复杂基质样品中的AFB1。     

基于纳米金和脱氧核酶荧光探针检测铅离子

本文以"8-17"脱氧核酶为识别靶标的配体,设计了一种基于纳米金(AuNPs)和脱氧核酶的荧光信号放大法检测Pb2+的探针。"8-17"脱氧核酶由一条底物链(17DS)和一条酶链(17E)组成。在底物链的一端修饰荧光基团6-羧基荧光素(FAM),而酶链通过巯基修饰到AuNPs表面。当底物链与酶链相混合时,酶链与底物链杂交,AuNPs与FAM靠近,导致FAM的荧光被AuNPs猝灭。当向该体系加入Pb2+时,"8-17"脱氧核酶被Pb2+激活,酶链将底物链剪切为两段,破坏了杂交的刚性结构,从而使得FAM的荧光恢复。基于此原理,构建了一种定量检测Pb2+的高灵敏传感器,该传感器对Pb2+的检测限达0.6nmol/L。     

基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测

构建了一种以分子信标（Molecular beacon, MB）为信号探针的CRISPR/Cas12a生物传感器,用于循环肿瘤DNA(Circular tumor DNA, ctDNA)的快速放大检测。MB具有良好的稳定性,其颈部末端分别标记有荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）两种荧光基团。ctDNA不存在时,CRISPR/Cas12a体系无活性,无法切割MB,因此MB两端的荧光基团由于形成发夹结构的颈部相互靠近而发生荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）,显示出TAMRA的荧光。当ctDNA存在时,ctDNA特异性识别Cas12a/crRNA二元复合物并激活Cas12a的反式切割活性。由于单链DNA是Cas12a最敏感的底物,因此MB的环部单链首先被切割,继而引起颈部双链的解离而导致两种荧光团彼此远离,无法发生FRET,最终显示出FAM的荧光信号。对MB环部的碱基数目、MB浓度以及crRNA与Cas12a的浓度比例等实验条件进行了优化。在最优条件下,1.7～500 pmol/L范围内,ctDNA浓度与传感...     

基于金纳米颗粒的比色传感体系用于前列腺特异性膜抗原的检测

发展了一种基于金纳米颗粒的比色传感体系用于检测前列腺特异性膜抗原的新方法.实验中合成了带有正电荷的金纳米颗粒,并设计了一段带有负电荷的前列腺特异性膜抗原的底物肽段.该方法基于金纳米颗粒聚集状态不同导致颜色变化的性质以及酶与底物的特异性识别作用,达到前列腺特异性膜抗原的检测.带正电荷的金纳米颗粒与带负电的肽段产生静电相互作用,引起金纳米颗粒的聚集;当体系中加入前列腺特异性膜抗原后,由于前列腺特异性膜抗原与肽段的特异性识别作用,带负电的肽段水解为谷氨酸碎片分子,导致金纳米颗粒的分散,反应体系颜色变化快速、明显.该方法简单、灵敏,线性范围为2～10 nmol/L,检测限为0.5 nmol/L.此外,该方法可用于标准加入法测定尿液中的PSMA.     

基于荧光共振能量转移的核酸适配体传感器检测环丙沙星

建立了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的核酸适配体传感器,并用于检测实际水体和牛奶中的环丙沙星（CIP）。为了防止羧基荧光素（FAM）被CIP猝灭,FAM和四甲基罗丹明（TAMRA）分别标记在互补单链DNA(FAM-cDNA)和适配体（TAMRA-APT）,通过DNA杂交发生FRET, TAMRA有效猝灭FAM的荧光。CIP加入后,其与FAM-cDNA发生亲和力竞争反应,CIP与TAMRA-APT形成结构更稳定的CIP/TAMRA-APT复合物,使体系FAM的荧光恢复。在优化条件下,本方法对CIP表现出高灵敏度和高选择性,检测浓度线性范围为0.01～1μmol/L,检出限为6 nmol/L;对实际水样和牛奶的加标回收率为90.4%～113.2%,相对标准偏差为1.8%～11%。该荧光适配体传感器具有成本低、灵敏度高、特异性好等优点,在环境中CIP残留快速检测方面具有良好的应用潜力。     

基于荧光偏振的高灵敏度蛋白激酶活性分析

利用TiO₂纳米棒与磷酸化肽的特异性相互作用,基于荧光偏振检测,建立了快速、简便的高灵敏度蛋白激酶活性分析方法. 在蛋白激酶催化作用下,荧光标记的肽底物被磷酸化,磷酸化的荧光肽通过磷酸基团特异性结合在TiO₂纳米棒表面,从而使底物肽上标记的荧光分子的旋转速率发生改变,通过对荧光偏振度进行测量,可实现蛋白激酶活性的定量检测,该方法对蛋白激酶A(PKA)的检出限可达0.0004 U·μL^-1. 此外,该方法还成功用于PKA抑制剂H-89的检测,在基于蛋白激酶抑制剂的靶向药物筛选方面具有很好的应用前景.     

模板合成银纳米颗粒/DNA复合物：生物硫醇的高效荧光传感平台设计

金属纳米颗粒经常被用作纳米猝灭剂构建高效荧光传感平台.在本工作中,以FAM标记的DNA为模板,通过还原Ag＋制备得到银纳米颗粒（AgNPs）.由于AgNPs与DNA间稳固的结合,模板合成AgNPs呈现出很高的猝灭效率并可用作超猝灭剂以构建生物荧光传感平台.作为一种尝试,模板合成的DNA-AgNPs复合物被用作生物硫醇荧光检测.通过形成S-Ag键,硫醇与AgNPs发生作用并将FAM标记DNA从AgNPs表面取代下来,FAM荧光恢复.由于低的荧光背景信号,该传感器具有高信背比.此外,DNA-AgNPs复合物呈现出很好的稳定性,可应用于复杂的实际样品.为验证其在实际样品中检测生物硫醇的可行性,测定了人类尿样中的硫醇含量,其结果显示人类尿样中的硫醇总含量为229μM到302μM.为验证结果的可靠性,少量Cys被额外加入到尿样中,其回收率经测定为98%～103%.     

基于磁珠和双链特异性核酸酶辅助目标循环技术构建荧光传感器用于MicroRNA的检测

基于磁珠(MBs)的分离富集和双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA单链的特性,建立了信号增强型荧光生物传感器用于microRNA-21(miR-21)的检测。荧光素(FAM)修饰的捕获探针(Cps),通过亲和素-生物素的特异识别作用固定在磁珠表面。当miR-21存在时,Cps与其杂交形成DNA/RNA双螺旋结构,DSN能特异性水解杂合双链中的DNA,同时释放出荧光标记片段和完整的miR-21。被释放出来的miR-21与另一Cp再次杂交并被DSN酶切,如此循环,从而实现恒温条件下一个miR-21与多个Cp杂交、酶切,释放出大量的荧光标记片段的循环过程,最终使体系的荧光强度明显变大。相反,当miRNA-21不存在时,Cps无法形成双螺旋结构,DSN对单链DNA无酶切作用,不能水解Cps,经磁分离,上清液没有荧光标记片段,所以检测不到荧光信号。最佳条件下,miR-21浓度在100~5×104fmol/L范围内,荧光强度与其浓度呈良好的线性关系,检测限达80 fmol/L。该传感器可以识别单碱基错配序列,有望为肿瘤早期诊断提供新思路。     

肿瘤细胞表面伞形胶束诱导特异性识别荧光增强与数字信号放大的单细胞轮廓可视化北大核心CSCD

以循环肿瘤细胞(CTC)的特异性膜蛋白EpCAM为识别受体,以羧基荧光素(FAM)标记的EpCAM核酸适体(Apt-FAM)为识别配体,当Apt-FAM特异性识别EpCAM后,细胞表面分布着大量的FAM荧光团,FAM荧光团的疏水性诱导非离子型表面活性剂Tween-80的疏水端在FAM周围聚积,形成以FAM为中心的伞形纳米胶束,从而增强了细胞膜的特异性识别荧光,提高了荧光信号的信噪比;利用数字信号放大技术,将成像细胞的膜荧光信号放大,使成像细胞的轮廓完整、清晰地呈现出来,实现了单细胞特异性识别轮廓的可视化,提高了捕获CTC计数和尺度估计的准确度。     

富含胞嘧啶单链DNA-银纳米簇荧光探针用于S1核酸酶的灵敏检测

以富含胞嘧啶（C）的单链DNA为模板合成银纳米簇,将其作为功能化探针,建立了一种无标记荧光检测S1核酸酶的方法.S1核酸酶可以特异性识别单链DNA,在最适的酶催化反应条件下,可将其降解为单核苷酸或寡核苷酸片段.当S1核酸酶不存在时,富含C的单链DNA可以有效地合成荧光银纳米簇;当S1核酸酶存在时,单链DNA模板被特异性识别并降解,导致无法形成银纳米簇,使体系荧光信号降低.实验结果表明,银纳米簇的荧光强度随着S1核酸酶浓度的增加而降低.在优化的条件下,体系荧光信号（F/F₀）与S1核酸酶的浓度在5.0×10^-5~4.0×10^-3 U/μL范围内呈线性关系,检出限为2.0×10^-6 U/μL.该荧光探针选择性好,可用于RPMI 1640细胞培养基中S1核酸酶的检测,回收率达到91.8%~109.5%.     

量子点荧光共振能量转移检测赭曲霉毒素A

基于量子点与荧光猝灭基团之间构成的荧光共振能量转移体系,以量子点标记赭曲霉毒素A适配体与荧光猝灭基团标记的补体杂交构成荧光传感探针,当有赭曲霉毒素A存在时,由于其适配体与赭曲霉毒素A的高度亲和作用,使传感探针上结合的荧光猝灭剂减少,荧光增强,从而建立了一种检测赭曲霉毒素A的荧光分析方法.该方法简单、快速、特异性强,在适...     

基于双重猝灭原理的分子信标定量检测凝血酶

利用G碱基和有机猝灭基团对荧光基团的双重猝灭作用构建了分子信标,建立了一种基于双重猝灭原理的检测凝血酶的简单方法.此分子信标中荧光基团设计为羧基荧光素(FAM),有机猝灭基团设计为Black Hole Quencher 1(BHQ-1),BHQ-1连接3个含有G碱基的核苷酸,分子信标的环设计为凝血酶的核酸适配体.体系中没有凝血酶时,分子信标呈茎环结构,荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ-1及G碱基相互靠近,FAM的荧光在BHQ-1及G碱基的双重猝灭下,其荧光信号很弱;当体系中有凝血酶存在时,分子信标与凝血酶特异性结合,形成G-四联体结构,茎-环结构被破坏,FAM远离猝灭基团BHQ-1及G碱基,其荧光得到恢复.在最适条件下,体系的荧光强度(△I)与凝血酶的浓度(C)在0.4~40 nmol/L范围内具有良好的线性关系,线性回归方程为△I=24.63C(nmol/L)+13.06(R2=0.9972),检出限为0.18 nmol/L(3σ,n=9).实际血样加标回收率为96.3%~98.7%.     

基于NaYF4:Yb,Er上转换荧光纳米颗粒精准检测DNA

建立了一种利用碱基堆积原理并以上转换纳米粒子荧光作为内参的精准检测DNA的方法。该方法首先利用热分解法制备NaYF₄：Yb,Er上转换荧光纳米颗粒（upconversion nanoparticles,UCNPs）,再通过表面羧基化变性牛血清蛋白修饰后与氨基化探针核酸单链共价偶联,形成上转换荧光标记显示探针。最后再基于碱基堆积原理进行杂交检测。研究结果表明以NaYF₄：Yb,Er荧光强度为内参,根据FAM/UCNP的强度比来定量检测目标DNA浓度比单一的以报告DNA中FAM荧光强度定量检测目标DNA浓度要更为精准,有效地避免了实验中出现的人为操作和仪器误差。本方法不需要进行扩增,检测底限可达到5 nmol·L^-1,且在较大的浓度范围内有较好的线性关系,同时该方法也有着良好的特异性,能有效区分单碱基错配序列。     

基于核酸碱基猝灭荧光团的核酸适配体传感器检测赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素A(OTA)是农产品中常见的霉菌毒素,对人和动物具有较强的毒性,以及致畸、致癌、致突变作用,因此,建立简单、快速、低成本、高灵敏的OTA检测方法是即时农产品质量监测和保障消费者安全的有效手段。本研究以鸟嘌呤碱基为猝灭剂,以单标记荧光素(FAM)的寡聚核酸为探针,基于核酸适配体构建了生物传感器,用于检测葡萄酒中的OTA。鸟嘌呤是具有多个给电子基团的稠杂环化合物,电子密度较大,在核酸碱基中氧化电位最低,最容易被氧化,作为电子供体可通过光诱导电子转移过程猝灭荧光基团。OTA不存在时,标记有FAM的寡聚核酸探针与OTA核酸适配体杂交,FAM靠近鸟嘌呤荧光被猝灭;样品中存在OTA时,其与核酸适配体特异性结合,形成四链体结构,抑制寡聚核酸探针与适配体结合,FAM的荧光得以恢复,通过FAM荧光强度的恢复率实现对OTA的检测。本方法检测OTA的线性范围为0.67～7.80 nmol/L,检出限为0.67 nmol/L (0.27μg/kg,S/N=3)。实际红酒样品中OTA的加标回收率为92.4%～100.9%。与纳米金、单壁碳纳米管、氧化石墨烯等纳米材料为猝灭剂的方法相比,本方法具有检测成...     

基于水溶性共轭聚合物分子刷的高灵敏凝血酶生物传感器

以刷子状水溶性共轭聚芴（PFNI）为传感材料,以荧光素标记的核酸适体（FAM-apt15）为探针,设计了一种检测凝血酶的高灵敏度蛋白质传感器. PFNI的刷状结构带有大量正电荷,与负电荷的柔性单链核酸探针形成静电复合物,使能量供体（PFNI）与受体（FAM）之间的距离较近,发生高效荧光共振能量转移（Föster resonance energy transfer,FRET）. 当探针与靶凝血酶结合时,形成刚性且体积较大的G-四链体/凝血酶复合物,由于体积位阻和密集的刷子的阻碍作用,PFNI与FAM之间的距离被拉大,FRET效率显著降低. 对缓冲溶液中凝血酶检测的最低检测限可达0.05 nmol/L. 与基于线型共轭聚合物的蛋白质检测方法相比,灵敏度提高了至少一个数量级.     

基于水溶性共轭聚合物分子刷的肿瘤标志物快速检测

以水溶性聚对苯撑乙炔分子刷(PPEB)为传感材料,荧光素标记的多肽为识别探针,设计了一种可实现肿瘤标志物快速、灵敏检测的蛋白质传感器。PPEB的刷状结构带有大量正电荷,与带负电荷的多肽形成静电复合物,使能量供体(PPEB)与受体(荧光素)之间的距离较近,发生高效荧光共振能量转移(FRET)。当多肽探针被前列腺特异性抗原(PSA)识别并切割为更小的寡肽片段时,由于肽段所带电荷量和等电点的变化,其与PPEB之间的静电作用减弱,能量供体和受体之间的距离增大,FRET效率降低。该传感器对PSA的检测可在40min内完成,具有良好的特异性和灵敏度。     

基于NaYF4:Yb,Er上转换荧光纳米颗粒精准检测DNA

建立了一种利用碱基堆积原理并以上转换纳米粒子荧光作为内参的精准检测DNA的方法。该方法首先利用热分解法制备NaYF_4∶Yb,Er上转换荧光纳米颗粒(upconversion nanoparticles,UCNPs),再通过表面羧基化变性牛血清蛋白修饰后与氨基化探针核酸单链共价偶联,形成上转换荧光标记显示探针。最后再基于碱基堆积原理进行杂交检测。研究结果表明以NaYF_4∶Yb,Er荧光强度为内参,根据FAM/UCNP的强度比来定量检测目标DNA浓度比单一的以报告DNA中FAM荧光强度定量检测目标DNA浓度要更为精准,有效地避免了实验中出现的人为操作和仪器误差。本方法不需要进行扩增,检测底限可达到5 nmol·L~(-1),且在较大的浓度范围内有较好的线性关系,同时该方法也有着良好的特异性,能有效区分单碱基错配序列。