亲和色谱中配基的筛选与应用

亲和配基的选择与筛选是发展新的亲和色谱填料或构建一个新的亲和色谱体系所必须解决的首要问题。该文结合作者所在实验室的工作,对配基的选择、筛选与应用方面的一些进展进行了简要评述。作者所在实验室针对特定蛋白质和多肽的多肽亲和配基的筛选,开展了反义肽简并性的研究,发展了基于反义肽的组合化学筛选新方法。与常规的组合合成法相比,该方法简单、快捷、有效,极大地减小了合成和筛选的工作量,降低了筛选后亲和组分结构鉴定的难度。所建立的筛选策略已应用于流感病毒、严重急性呼吸道综合征(SARS)病毒亲和抑制剂的筛选和用于人β-干扰素测定的石英晶体微天平（QCM）生物传感器的构建,均取得了有意义的结果。     

从组合化学肽库中筛选亲和配基

在亲和色谱研究中 ,建立适合于某种分离对象的亲和色谱体系的关键是寻找适合的亲和配基 .小肽亲和配基具有性质稳定、合成简单、价格低及生物相容性好等特点[1] ,但这类配基也存在着亲和力弱或选择性低的缺点 .因此 ,如何寻找小肽配基以及如何提高小肽配基的亲和力和选择性的问题引起了人们的关注与重视 [1～ 3 ] .组合化学法是一种快速制备大量相关或同类化合物的革新性的方法 [4 ] ,组合肽库包括噬菌体展示肽库和合成肽库 ,这两类肽库均可用于小肽配基的筛选与优化 [1,5] .组合化学法尽管有效 ,但以小肽为目的物进行筛选时 ,往往因肽 -肽…     

亲和色谱用无色合成配基对胰蛋白酶纯化功能的研究

考察了一种新型的阳离子无色三嗪化合物、几种阴离子无色三嗪化合物和三嗪染料作为亲和色谱配基对胰蛋白酶的吸附性能。猪胰蛋白酶经阳离子型配基一步纯化,比活达到１１６Ｕ／ｍｇ,纯化２１．６倍,回收率８８％。     

膜亲和色谱的现状、发展和应用

文章对膜亲和色谱的原理、特点、设备、过程和发展情况做了介绍，并对亲和膜在整个膜分离技术中的地位、所占的比重及市场预测做了述评，对膜亲和色谱与其它色谱分离技术的优缺点进行了比较。重点介绍了制备亲和膜的材料，活化方法，间隔臂和配基的种类、选择和共价键合方法，配基和配合物产生亲和作用的机理及解离过程和方法。并对膜亲和色谱在酶、蛋白质、核糖核酸等生物大分子纯化分离方面的应用情况做了述评。     

膜亲和色谱的现状、发展和应用

文章对膜亲和色谱的原理、特点、设备、过程和发展情况做了介绍，并对亲和膜在整个膜分离技术中的地位、所占的比重及市场预测做了述评，对膜亲和色谱与其它色谱分离技术的优缺点进行了比较。重点介绍了制备亲和膜的材料，活化方法，问隔臂和配基的种类、选择和共价键合方法，配基和配合物产生亲和作用的机理及解离过程和方法。并对膜亲和色谱在酶、蛋白质、核糖核酸等生物大分子纯化分离方面的应用情况做了述评。     

应用卵黄免疫球蛋白作为亲和配基分离目的蛋白的研究

实验通过给母鸡注射抗原BSA－V，从鸡蛋中分离获得抗体IgY。以BSA－V作介质分离纯化IgY后，IgY纯度可达电泳纯，且抗体活性提高了35倍以上。反之，将纯化后的特异性IgY为介质亲和分离胎牛血清中的BSA，分离后的BSA纯度可达电泳一条带，明显高于市售产品。以卵黄免疫球蛋白为配基的亲和介质在4℃条件下可保存半年以上，且柱的最大载量基本保持恒定。同时测定出卵黄中特异性IgY可占到总IgY的5％左右。     

胰蛋白酶定向固定化亲和配基的理性设计

在胰蛋白酶三维(3D)结构的基础上, 首先利用分子对接从ZINC 数据库中筛选获得了与胰蛋白酶具有较高亲和性的小分子配基2-硝基苯基-β-D-葡糖苷, 并分析了该配基与蛋白质之间的相互作用力主要为范德华和氢键相互作用. 并利用分子动力学模拟进一步验证了2-硝基苯基-β-D-葡糖苷与胰蛋白酶之间具有较强的亲和作用. 分子动力学(MD)模拟结果表明, 配基-目标蛋白质之间形成稳定的复合物且它们之间的距离基本没有变化. 此外, 一个水分子通过氢键在配基和目标蛋白质的结合腔之间架桥. 最后制备了偶联有该配基的亲和载体, 进行了胰蛋白酶的定向固定化, 并考察了该固定化酶的活性. 研究结果表明, 利用修饰2-硝基苯基-β-D-葡糖苷配基的亲和载体固定化胰蛋白酶的酶活达到340.8 U·g^-1, 比活达到300.3 U·mg^-1, 分别是未修饰亲和配基载体的10倍和5倍, 具有明显的优势. 上述结论证明了结合分子对接和分子动力学模拟理性设计定向固定化亲和配基的方法是可行的, 具有一定的理论和实用价值.     

亲和膜色谱技术研究进展

对一种崭新的生物大分子分离技术－－亲和膜色谱技术做了全面的评述,介绍了亲和膜色谱分离的过程,评价了亲和膜基质材料活化、改性方法、给出了配基间隔臂的选择原则,概括了亲和膜色谱理论研究的进展,并对亲和膜色谱技术进行了展望。     

亲和膜色谱

亲和膜色谱又称亲和膜分离，其在蛋白质的分离纯化中作为一种综合性的技术出现在80年代末。亲和膜色谱主要优点是克服了颗粒状多孔载体扩散传质阻力大的缺点，代之以对流传质，这样就可以在较低的操作压和较高的流速下对目标蛋白进行快速的分离和纯化，从而缩短操作时间、提高纯化效率。本文将就近年来亲和膜色谱及其在蛋白质分离和纯化中的应用作一综述性介绍。     

利用亲和选择筛选法从组合化学库中筛选新药

组合化学方法可以产生大量的新化合物供新药筛选，但传统的逐一筛选法不能满足如此数量庞大的化合物，因此，针对混合物进行筛选显得非常重要，亲和选择筛选法利用药物作用的靶蛋白与潜在药物之间的亲和活性，使目标化合物与大量无亲和活性的化合物分离，然后只对有亲和活性的化合物进行结构鉴定，从而快速地从大量混合物中找到目标化合物，本文着重讨论了亲和选择筛选的的几种形，相应技术和在组合化学库筛选中的应用，亲和选择筛选大体分为两种方式：一种是将靶蛋白固定在支持物上，有亲和活力的化合物被保留，大量非亲和化合物被洗掉，另一种是在溶液中靶蛋白与混合物库孵育，然后利用受体配基复合物与不结合的游离化合性质的判别进行区分，亲和选择筛选法也适合于化合物的种类和含量都未知的天然提取物的筛选。     

Isolation of Ligands of Trace Metals from Plant Samples by Immobilized Metal Affinity Chromatography

Abstract

Isolation of ligands of trace elements from plants by affinity chromatography with a metal immobilised on iminodiacetate resin has been investigated. To simulate various types of bioligands the following compounds were tested: phytic acid, peptides containing Cys and peptides containing Asp. Optimal conditions allowing isolation of the peptides with good efficiency comprise the use of Ga³⁺ ion, sample adsorption at pH = 4 and elution of the compounds by 0.3 mol/l NH₃. Phytic acid was bound too tightly and was not eluted. The procedure was used for purification of extracts of rye flour. The purified sample is suitable for analysis by MALDI-MS.     

Affinity Chromatography of Insulin with a Heptapeptide Ligand Selected from Phage Display Library

A heptapeptide phage display library was screened with insulin to find its ligands for affinity chromatography. The peptide was synthesized and coupled to EAH Sepharose 4B (5.4 mol mL^–1 bed). Then, insulin chromatography was carried out with mobile phases of different pH values and by the addition of urea and ethylene glycol. It was found that electrostatic interactions were predominant for the affinity binding, and hydrogen bonding might also contribute somewhat to the affinity. Finally, frontal analysis was performed and the dynamic binding capacity of the affinity column for insulin at 50% breakthrough was estimated at 60.6 mg mL^–1 bed, which was about two times higher than the theoretical binding capacity of the monomeric insulin. The result suggests that insulin was bound in dimer state in a stoichiometric relationship with the coupled peptide, indicating the high binding efficiency of the peptide ligand for insulin.     

亲和色谱法的进展

概述了亲和色谱法分离机理、色谱填料及其应用的新进展,着重介绍了亲和固定相中配基发掘的新途径。全文包括66篇文献。     

硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱材料的合成及应用

合成了硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱材料,首先对间氨基苯硼酸进行硝基化,制得3-氨基-4-硝基苯硼酸功能基团,通过γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷把功能基团键合到硅胶基体上,在20.7MPa压力下装成亲和色谱预柱(35mm×4.6mmi.d.)。用该预柱通过六通阀后接ODS分析柱(250mm×4.6mmi.d.),构成中心切割二维HPLC。该系统能对含有顺二羟基结构的化合物进行在线富集,实现生物复杂样品直接进样分离分析。使用该系统对尿中多种修饰核苷进行了分离分析,以pH值7.95的0.25mol/LNH4Ac碱性缓冲液把实际尿样(100μL)中核苷保留在预柱上,生物大分子无保留通过,再切换六通阀,以pH4.50的25mmol/LKH2PO4酸性洗脱液把保留在预柱上的核苷洗脱,进样到下一级ODS分析柱柱头上聚焦,然后用梯度洗脱法(pH4.50的25mmol/LKH2PO4缓冲液与体积比60∶40的甲醇-水梯度混合构成洗脱液)完成核苷在ODS分析柱上的分离(紫外检测260nm),11种目标核苷的分离分析取得了良好的定性定量结果。     

亲和层析在蛋白质研究中的应用进展

文中介绍了生物、免疫、固定化金属离子拟生物几类常规亲和层析的原理及其在蛋白质分离纯化以及分析鉴定方面的应用（引用文献25篇）。     

Aptamer-Based Alternatives to the Conventional Immobilized Metal Affinity Chromatography for Purification of His-Tagged Proteins

Aptamers are oligonucleotides or peptide molecules that are able to bind to their specific target molecules with high affinity via molecular recognition. In this study, we present development of aptamer-based affinity purification for His-tagged proteins for comparison of purification efficiency with the conventional Ni²⁺-based affinity chromatography. Thiol-functionalized aptamers able to specifically bind to His-tag were immobilized employing two crosslinking methods onto the surface of polystyrene resins. The resulting aptamer-anchored resins were successfully applied for purification of His-tagged proteins from complex E. coli and human cell lysates, respectively, and superior or at least comparable purification results to the conventional immobilized metal affinity chromatography were obtained via one-step purification.