小球藻Chlorella variabilis NC64A二酰甘油酰基转移酶基因的克隆表达与功能研究

为了揭示二酰甘油酰基转移酶(DGAT)在小球藻油脂合成过程中的作用, 对单细胞小球藻Chlorell avariabilis NC64A 的二酰甘油酰基转移酶进行原核克隆表达及功能初步研究。结果表明, 其编码序列为894bp, 编码 297 个氨基酸, 表达蛋白的表观分子量为 33 kDa, pI 9.48。保守结构域分析表明, 该蛋白属于Lysophospholipid acyltransferases (LPLATs)超家族, 具有二酰甘油酰基转移酶活性, 序列位点H68, L71, F76, R94, I97 和GAA (144?146)组成特定的酰基受体结合口袋, 能够结合酰基?酰基载体蛋白(ACP)或者酰基辅酶A上的酰基, 催化三酰甘油合成的最后一步。表达蛋白与SsPDAT 和AtPDAT 的序列相似性分别为32%和24%, 表明该蛋白可能具有磷脂酰甘油酰基转移酶(PDAT)活性, 能利用磷脂上的酰基合成三酰甘油。因此, 采用薄层层析方法以L-α-磷脂酰胆碱和 1,2-二油酰-sn-甘油为底物, 检测到其确实具有PDAT 活性, 表明限氮条件下NC64A 中DGAT 的PDAT 活性可能促进了膜脂降解耦合三酰甘油的合成。     

豌豆中GPAT基因编码cDNA的克隆及分析

参照国外报道的豌豆ＧＰＡＴ基因ｃＤＮＡ序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，通过ＲＴＰＣＲ技术，从云南地方栽种的豌豆品种中分离到了ＧＰＡＴ基因的编码ｃＤＮＡ片段，并将其纯化后直接克隆到ｐＧＥＭＴ载体系统中，经ＮｃｏⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切鉴定，所得的重组质粒中含有１３８０ｂｐ左右的片段．采用ＰｓｔⅠ，ＨｉｎｄⅢ两种限制性内切酶进行酶切，酶切图谱分析表明所克隆的豌豆ＧＰＡＴ基因编码ｃＤＮＡ的酶切图谱与国外所报道的该基因ｃＤＮＡ的酶切图谱一致，暗示了该基因在进行上具有一定的保守性．     

重组质粒pPAHD1的限制性内切酶图谱分析

本文对我们构建的含有青霉素酰化酶(Acylace)基因的重组质粒pPAHD1进行了限制性内切酶图谱的测绘。使用了限制酶14种,证明BglⅡ,SalⅠ,SmaⅠ和BamHⅠ在重组质粒上各有切点一个;EcoRⅠ有切点两个:HindlⅡ,AvaⅠ各有切点三个;PvuⅠ有切点四个;EcoRⅤ和XmnⅠ各有切点五个。     

谷氨酸棒杆菌GPAT功能基因鉴定与分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是三酰基甘油(TAG)合成过程中的关键酶.以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CG14为研究对象,利用生物信息学预测了Corynebacterium glutamicum ATCC13032编码GPAT的多个候选功能基因,并选择其中之一cg2777基...     

克隆含有MT—I和MT—Ⅱ基因的染色体DNA片段及其内切酶图谱的鉴定

用小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ作为探针，从１２９小鼠的基因组库中获得含ＭＴ－Ⅰ基因的ＤＮＡ片段。从６．８＊１０＾５的噬菌斑中挑出４个阳性噬菌体克隆，分别命名为１－１，２－２，１－６和４－３。     

甘油-3-磷酸对甲肝疫苗诱导的体液免疫影响*

目的 研究甘油-3-磷酸对甲肝疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法 选取49只雌性ICR小鼠,分7组,每组7只,这7组小鼠分别为阴性对照、单纯抗原组、铝佐剂组和4组甘油-3-磷酸组,分别在免疫之后的第4、8、12、16、20周用酶联免疫法(ELISA)测定小鼠血清中的特异性的anti-HAV IgG水平。结果 在小鼠免疫之后的第4、8、12、16、20周单纯抗原组、铝佐剂组和4组不同剂量甘油-3-磷酸组均能检测到特异性抗HAV抗体,并且趋势为先升高后降低,且在免疫后的第8周最高;第4周和第8周的甘油-3-磷酸实验组的结果均高于单纯抗原组,且差异均具有统计学意义(P<0.05),并且第4周甘油-3-磷酸组抗体水平均超过铝佐剂组,并具有统计学意义(P<0.05),其中甘油-3-磷酸2 mg为最佳剂量组,其抗体水平在免疫后的第4、8、12、16、20周均高于单纯抗原组,且在第8周抗体水平达到峰值,抗HAV IgG水平为lg(3.064±0.07851),铝佐剂的也是在第8周抗体水平达到峰值,抗HAV IgG水平为lg(3.150 ±0.1382)。结论 甘油-3-磷酸有免疫佐剂的作用,能够有效、迅速地增强HAV诱导的体液免疫应答,是一种潜在、安全有效的新型疫苗佐剂。     

129小鼠CgA基因cDNA 5'端部分片段及CgA基因的克隆

通过RT-PCR方法,从129小鼠脑组织中克隆到CgA基因cDNA 5'端部分片段,序列分析结果表明,所克隆到的片段序列与文献中完全一致.以此片段为探针,从129小鼠基因组库中筛选获得阳性噬菌体1-1,克隆了CgA基因,并与文献中的小鼠CgA基因限制性内切酶图谱进行了比较分析.     

山羊ZP3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对高繁金堂黑山羊和低繁藏山羊ZP3基因cDNA进行克隆、序列分析,并采用Real-time PCR技术对其在发情前期母羊卵巢组织的表达进行研究.结果表明:山羊ZP3基因编码区全长为1269bp,共编码422个氨基酸,两品种间有2处碱基差异,但未导致氨基酸的差异.山羊的ZP3基因在卵巢表达量高,与其他组织差异极显著(P＜0.01),但两个品种间差异不显著(P＞0.05).说明ZP3基因主要在卵巢中表达,但可能不是影响山羊多羔性状的主基因.     

129小鼠CgA基因cDNA 5′端部分片段及CgA基因的克隆

通过RT-PCR方法,从129小鼠脑组织中克隆到CgA基因cDNA 5′端部分片段,序列分析结果表明,所克隆到的片段序列与文献中完全一致。以此片段为探针,从129小鼠基因组库中筛选获得阳性噬菌体1-1,克隆了CgA基因,并与文献中的小鼠CgA基因限制性内切酶图谱进行了比较分析。     

加工番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的cDNA克隆

以加工番茄８７－５为材料,运用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地将ＰＧ基因的ｃＤＮＡ序列克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,并利用酶切及ＰＣＲ进行了初步鉴定。     

克隆含有MT-Ⅰ和MT-Ⅱ基因的染色体DNA片段及其内切酶图谱的鉴定

用小鼠MT-ⅠcDNA作为探针,从129小鼠的基因组库中获得含MT-Ⅰ基因的DNA片段。从6.8×10⁵的噬菌斑中挑出4个阳性噬菌体克隆,分别命名为1-1, 2-1, 1-6和4-3。在这4个克隆中1-1和2-1的阳性信号更强些。应用插入片段的末端引物作为探针进行杂交结合部分酶切的方法,对这2个克隆的插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,确定了克隆1-1和2-1的酶切图谱及MT-Ⅰ基因在2个克隆DNA中的位置。并进一步发现和证明了在2个克隆中含有MT-Ⅱ基因。     

甜菊(Stevia rebaudiana)糖基转移酶基因的克隆及序列分析

利用与植物次生代谢产物糖基化相关的UDPG糖基转移酶的特征性保护区域，设计了同源简并引物，以甜菊基因组DNA为模板，PCR扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段，根据获得的基因片段设计引物GSTr和GSTf，分别与cDNA文库的T3和T7通用引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因，定名为sud pt-2，该基因全长1662bp，包括poly(A)和一个1362bp的开放阅读框，编码454个氨基酸。与常见的糖基转移酶基因的相似性达44％-77％，且具有UDPG糖基转移酶的特征性保守序列。分子发育进化分析表明，此基因为类黄酮糖基转移酶基因家族成员。     

Cloning and expression analysis of MBLL cDNA

The mbl (muscleblind) gene of Drosophila encodes a nuclear protein which contains two Cys3His motifs. The mutation of mbl gene will disturb the differentiation of all the Drosophila's photoreceptors. Primers have been designed according to human EST086139, which is highly homologous to mbl gene. Human fetal brain cDNA library has been screened and a novel cDNA clone has been obtained. The 2595 bp cDNA, designated MBLL (muscleblind-like), contains an open reading frame which encodes 255 amino acids and has 4 Cys3His motifs (GenBank Acc. AF061261). The amino acids sequence shares high homology to Drosophila's mbl. The Northern blot and RNA dot blot hybridization of 43 human adult tissues and 7 fetal tissues show that MBLL is a widely expressed gene, but the expression amounts differ in these tissues.     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的衍生质粒pAl32的酶谱及抗性基因定位

从短小芽孢杆菌四环素抗性质粒pCJ3截短的衍生质粒pAL32,经用6种限制酶双酶解试验,根据琼脂糖凝胶电泳带估算各片段的分子量,作出了pAL32的6种限制酶图谱。利用已除去复制功能的金黄色葡萄球菌质粒pUB110与pAL32构建的Km~rTc~r的双抗性重组质粒pSC33为载体,在EcoRV位点克隆的λDNA片段的重组子均为Km~rTc~s。用pUB110与pAL32在PvuⅡ位点连接后的重组质粒也为Km~rTc~s。根据这些重组子四环素抗性的失活,推知pAL32上EcoRV与PvuⅡ切点均位于其四环素抗性基因上。     

马尾松PmCBL3基因的克隆及其表达分析

【目的】为明确马尾松(Pinus massoniana)CBL基因结构特征及干旱胁迫下的表达特性,探讨该基因在马尾松抗旱调控过程中的生物学功能。【方法】以马尾松优良家系为试材,采用RT-PCR和RACE方法克隆马尾松CBL基因全长cDNA,运用生物信息学方法,分析其蛋白质性质和亲缘关系,利用荧光定量PCR分析干旱胁迫下的基因表达特性。【结果】获得马尾松的一个CBL同源基因,命名为PmCBL3,该基因cDNA序列全长1 035 bp,包括681 bp的完整开放阅读框,编码226个氨基酸。PmCBL3蛋白含4个EF-hand功能域,且相邻EF-hand功能域之间的氨基酸数目非常保守,属于EFh家族蛋白。系统进化分析表明:该蛋白与其他植物CBL同源性达62%～98%,其中与北美云杉(Picea sitchensis)CBL亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,PmCBL3在马尾松根中表达量最高,茎和叶次之; 干旱第15天表达量最大,随干旱胁迫加剧,表达量逐渐降低。【结论】PmCBL3基因属于CBLs家族,与北美云杉亲缘关系最近。该基因响应干旱胁迫,推测其可能参与马尾松干旱逆境的应答调控。     

中间锦鸡儿CiCesA3的克隆及表达分析

为了研究中间锦鸡儿Caragana intermedia纤维素合酶基因(cellulose synthase,CesA)的结构及表达特性,通过同源克隆及RACE(rapid amplification of cDNA end)技术,获得1条中间锦鸡儿CesA基因的全长cNDA序列.NCBI Blast结果显示该基因与野生大豆Glycine soja基因GsCesA3相似度最高(94%),因此命名为CiCesA3.CiCesA3基因cDNA全长为3 475 bp,其中5'UTR长为175 bp,3'UTR长为76 bp,开放阅读框长度为3 225 bp,编码1 075个氨基酸.CiCesA3蛋白预测分子质量为119.89 ku,第16位到第79位氨基酸为CesA蛋白保守的锌指结构(Cx2Cx12FxACx2CxEx5Gx3Cx2C).CiCesA3蛋白C端有6个跨膜结构域,为亲水性蛋白.qRT-PCR检测不同组织中基因表达量的结果表明CiCesA3在叶中表达量最高.以上结果证明中间锦鸡儿CiCesA3基因与其他植物CesA基因相似,并无变异,为阐明中间锦鸡儿纤维素的合成提供了依据.     

旱麦草LEA3基因的克隆与序列分析

为了克隆旱麦草LEA3基因,根据小麦的LEA3基因(GenBank登录号为AY148492)cDNA序列设计引物,以干旱胁迫处理的旱麦草幼苗的cDNA为模板,采用RT-PCR克隆了旱麦草LEA3基因,命名为EtLEA3(GenBank登录号为KJ123698),并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:EtLEA3基因的ORF全长为600 bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白相对分子量为20.38 ku,理论等电点为9.08。其氨基酸序列与小麦、大麦和山羊草LEA3蛋白的相似性分别为83%、82%和81%。信息学分析表明EtLEA3蛋白具有较高的亲水性,没有跨膜结构。蛋白质二级结构和三级结构预测表明α-螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。该蛋白含有5个完整的11个氨基酸组成的串联重复单元。这些特征均与第3组LEA蛋白的特征相符合。该研究结果为深入了解该基因的功能和旱麦草抗旱的分子机理提供了基础数据。     

人胎盘G-蛋白Rab3a cDNA的克隆

为了获取全长的小分子G-蛋白Rab3a,以用于研究Rab3a与其他蛋白相互作用关系,本实验以人胎盘总cDNA为模板,PCR扩增到人Rab3a cDNA全编码区。产物回收后克隆于质粒pYESTrp2的BamHI/XhoI位点,测序结果表明,本实验获得的Rab3a cDNA包含了起始和终止密码子。与PCR引物设计的参照Rab3a比较有5个核苷酸变异,与翻译的氨基酸序列完全一致。由此表明本实验获得的Rab3a cDNA可用于进一步研究。     

番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建

八氢番茄红素合成酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄该酶的编码基因序列设计一对引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1500 bp的全长cDNA片段.测序结果表明,此片段包含一个长为1239 bp的完整的编码框,其氨基酸序列与辣椒、向日葵、万寿菊、枸杞、番木瓜、温州蜜柑、拟南芥八氢番茄红素合成酶基因编码的氨基酸序列的一致率分别为88%、75%、75%、74%、73%、73%、7l%.对这个全长片段构建了超量表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体.     

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究

根据同源性设计引物，通过RT－PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因，并由此推测出其相应的氨基酸序列。将该基因克隆到表达载体pPIC9K中，经电激转化后整合至毕氏酵母细胞中获得表达。该表达产物经两步柱层析后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得单一条带，并表现较强的生色底物活性。