耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲＩ酶不完全消化，与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ酶切产物在体外重组后，转化大肠杆菌ＨＢ１０１．在碱性平板上直接筛选耐碱转化子，转化子经检测具有氨苄青霉素（Ａｍｐｒ）抗性，分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒．用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１、ＤＨ５α和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子．通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为ｐＧＣＡ）由ｐＵＣ１８和ＮＴＴ３６总ＤＮＡ的片段组成．分别提取上述３种克隆转化子和ＮＴＴ３６细胞膜蛋白，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ梯度凝胶电泳，发现在ｐＨ１０．６条件下培养的转化子和供体菌ＮＴＴ３６与在中性培养基中生长的转化子和受体菌相比，有５条多肽带有明显差异．表明这５条多肽带与耐碱性有关．     

猪瘟病毒石门株E2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了猪瘟病毒石门株的Ｅ２基因．扩增片段大小为１１８４ｂｐ，与预期大小一致．经ＳａｃＩ酶切和巢式ＰＣＲ证实了Ｅ２基因的特异性．将Ｅ２基因扩增片段首先克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，进行全序列测定，将该基因再克隆到表达载体ｐＢＶ２２１．采用温控诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示Ｅ２基因获得表达．ＥＬＩＳＡ表明Ｅ２基因表达产物可与猪瘟阳性血清起特异性反应．     

碱性果胶裂解酶基因pelA在E.coli中的表达和酶学性质研究

根据核苷酸序列分析结果设计引物,通过PCR的方法,在嗜碱芽孢杆菌NTT33的总DNA和p1350中分别扩增到预计大小的片段,证明p1350中的外源DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌NTT33.同时也获得了含有pelA完整ORF的DNA片段.经计算,该基因表达的成熟蛋白质的分子量为34.76×103.构建表达载体pBV220-pel,在E.coliDH5a中进行表达.SDS-PAGE检测发现,表达的蛋白质分子的大小约为35×103,与预测的相符.初步研究其酶学性质发现,该酶在pH9.0～pH10.0,45℃的条件下有较高的活性,而且必需Ca2+参与反应.     

黄颡鱼MyoD基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)方法克隆黄颡鱼MyoD(myogenic differentiation antigen,成肌分化抗原)基因的cDNA全长序列,对其进行生物信息学和在雌雄个体组织中的表达差异分析.结果表明,黄颡鱼MyoD基因编码区由810个碱基组成,编码269个氨基酸,其中第1～89个氨基酸为Basic区,第90～141个氨基酸为bHLH结构;黄颡鱼的MyoD基因与斑点叉尾鮰的同源性最高为93%.在雌雄成体组织中的表达分析显示,雄性个体中肌肉和胃组织中的表达量极显著高于雌性个体(p<0.01),雌性个体的肾脏和鳃组织中的表达量显著高于雄性(p<0.05).通过MyoD基因在雌雄个体中表现出的组织表达差异,认为这可能是造成黄颡鱼雌雄生长差异的重要因素之一.     

猪胃蛋白酶原A基因cDNA的克隆及其表达

根据GenBank中发表的猪胃蛋白酶原A（pepsinogen）基因序列设计引物，采用RTPCR技术，成功获得了猪胃蛋白酶原A基因，该基因全长1240bp，将该基因克隆到表达载体pPIC3．5K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点构建重组表达质粒，通过电转化方法将重组质粒转化毕赤酵母GS115，检测结果表明猪胃蛋白酶原A基因在毕赤酵母中得到了表达．     

半滑舌鳎两种Aquaporinl同源基因的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AQP1o和AQP1基因的全长cDNA序列,并对其序列和表达模式进行了分析.结果表明,AQP1o cDNA全长为993 bp,包括120 bp的5'非翻译区,789 bp的开放阅读框,84bp的3'非翻译区,编码262个氨基酸的蛋白质,分子质量为28.3×103.AQP1的cDNA全长为1 335 bp,包括63bp的5'非翻译区,786 bp的开发阅读框,486 bp的3'非翻译区,编码261个氨基酸的蛋白质,分子质量为27.4×103.聚类分析表明半滑舌鳎AQP1o蛋白与金头鲷和塞内加尔鳎等海洋鱼类在卵巢中特异表达的AQP1o聚为一类,而AQP1与非卵巢特异表达的AQP1聚为一类,表明该两类基因为不同类型的AQP1同源基因.RT-PCR分析表明两个基因具有不同的表达模式,AQP1o主要在卵巢中表达,提示其在卵巢中具有特定的生理功能、而AQP1则在雌雄鱼的多种组织中表达.     

HCVNS2基因表达载体的构建及在E.coli中表达

PCR人含有丙肝病毒全长非结构蛋白的载体pBlueBac25中扩增出全长的NS2基因DNA片段,分别克隆到表达载体pQE30和转座载体pFasBacHTb的多隆位点（MCS）,PFastNS2通过转座插入穿梭载体Bacmid的表达盒;pQENS2转化JM109菌株,诱导表达出N端含有6个His的全长His的全长NS2蛋白,用Ni-NTA-agarose柱层纯化,获得提纯的全长NS2蛋白。     

人新型肿瘤坏死因子在E.coli中的 高效表达、纯化及诱导凋亡活性

采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因,在153位氨基酸处引入突变,使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中,SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达.通过Ni金属鳌合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白,Westernblot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清发生特异性反应.荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性.     

嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的克隆及其表达

报导了以启动子探测质粒pKK232-8为载体克隆嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的研究.用限制性内切酶Hindl分别消化嗜碱芽孢杆菌NTT89染色体DNA和质粒pKK232-8,在体外重组,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择性平板上筛选转化子,结果从NTT89染色体DNA中克隆到一系列带有启动子活性的DNA片段,并在大肠杆菌中得到表达,这些转化子抗氯霉素水平在34～500mg/L不等,随机挑选10个转化子,提取其重组质粒进行限制性酶切,表明转化子中的重组质粒外源片段插入的效率很高,插入片段大小在500～5500bp之间,通过地高辛标记的点杂交和Southern杂交均证明重组质粒上插入的具启动子功能的DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌的染色体DNA.     

谷氨酰胺合成酶基因的过量表达有效提高谷氨酸棒杆菌中L谷氨酰胺产量

以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板,通过PCR扩增,得到大小为1434bp的谷氨酰胺合成酶基因glnA.以大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19为载体,将扩增得到的目的基因片段克隆至C.glutamicum Res167,获得重组菌株C.glutamicum Res167/pXMJ19-glnA.在摇瓶发酵水平上,通过IPTG诱导glnA基因的表达,并采用反相高效液相色谱方法测定了发酵液中的L-谷氨酰胺含量.结果显示,与未经诱导的对照菌相比,诱导后的重组菌发酵液中的L-谷氨酰胺产量提高了1.8倍,最高产量达1.54·gL-1.     

人nov基因全长cDNA克隆、测序及其组织表达谱分析

采用特异性mRNA富集技术，从人早期胚胎中得到人nov基因(novH)的cDNA克隆，序列分析表明，该基因cDNA序列由2389个碱基对组成，包含一段长1071bp的开放阅读框(ORF)，3′端含有加尾信号AATAAA和ply(A)尾巴。Northern杂交显示，在Hela细胞和肾上腺组织中有表达的novHmRNA，大小约为2．5kb；多组织RNA点杂交分析结果进一步表明，novH基因在肾上腺和主动脉中的表达水平相对较高，在成人肾、肝、肺和小肠组织中亦有少量的表达。     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

三角褐指藻DGAT1基因生物信息学分析及表达调控研究

本研究采用转录组测序获得了三角褐指藻DGAT1基因cDNA全长序列(GeneBank登录号: 7200924), 并对其进行生物信息学分析和表达调控研究. 结果表明, 三角褐指藻DGAT1基因cDNA序列全长为1438bp, 开放阅读框(ORF)为1098bp, 编码365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG结合位点(II)等功能结构域. 预测三角褐指藻DGAT1蛋白为亲水性蛋白, 含有6个跨膜结构域和7个超强跨膜螺旋区, 无信号肽. 进化树分析表明, 三角褐指藻与海链藻DGAT1蛋白同源性最高. RT-qPCR结果表明, 光照强度和温度均显著促进三角褐指藻DGAT1基因的表达. 随着光照强度和温度的增加, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量呈先升高后降低趋势, 在光照强度为2500lx或温度为25℃时, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量达到最大, 这与三角褐指藻总脂含量的变化趋势一致, 同样揭示DGAT1蛋白与三角褐指藻总脂生物合成与积累密切相关.     

抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法,从人脑ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中克隆 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ 基因扩增得到５５３ ｂｐ 片段克隆于ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｔ 载体,测定了其 Ｄ Ｎ Ａ 序列该序列包括 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 编码区全部４４４ ｂｐ,以及５′端５２ ｂｐ 和３′端５７ ｂｐ 非编码区序列编码区有二处位点发生突变：第９２位密码子中的 Ｃ突变成 Ｇ,是同义突变,不导致氨基酸改变;第１１２位密码子中的 Ｃ也突变成 Ｇ,导致由 Ｔｈｒ变为 Ｓｅｒ到目前为止尚未发现有 Ｆ Ｈ Ｉ Ｔ 基因编码区内部点突变导致氨基酸改变的报导     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

小鼠B7-1cDNA克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法,从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后,插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１,经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与文献报道一致．通过脂质体介导将ｐＣＤ－ｍＢ７．１导入Ｂ７－１的小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６（Ｆ０）中,经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＮＡ斑点杂交初步证实Ｂ７－１在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达．同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用ＬＤＨ释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性,结果显示,与野生型和模拟转染的Ｂ１６细胞相比,Ｂ７－１基因转染的Ｂ１６细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型Ｂ１６细胞的特异杀伤活性（ｐ＜０．０２）．这说明,将Ｂ７－１基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性,诱导有效的抗肿瘤免疫反应     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．