钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取工艺优化及其纯化研究

以钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻蓝蛋白(Phycocyanin)的纯度和回收率为指标,考察溶胀法和冻融法中不同破壁影响因素及活性炭吸附法中活性炭目数、活性炭加入量和吸附时间对藻蓝蛋白粗提的影响,并结合响应面分析法优化提取工艺参数,得到最优破壁条件和活性炭吸附条件。结果表明,溶胀法最优提取条件为料液比1∶50(g/mL),溶胀时间24h,溶胀次数2次,测得藻蓝蛋白纯度为0.47,得率为2.17%;冻融法最优提取条件为料液比1∶50(g/mL),冷冻时间8h,冻融次数2次,测得藻蓝蛋白纯度为0.34,得率为2.19%。活性炭吸附法最优工艺条件为300目活性炭,活性炭加入量0.7g/20mL,吸附时间10min,藻蓝蛋白纯度为0.80,回收率为73.23%。疏水层析法纯化得到食品级藻蓝蛋白(纯度P≥0.7)和医药级藻蓝蛋白(纯度P≥3.0),总回收率为61.15%。因此,溶胀-活性炭吸附-疏水层析三步提纯藻蓝蛋白工艺合理可行,实现了医药级藻蓝蛋白的分离提纯,降低了工业生产成本,具有实用价值。     

螺旋藻藻蓝蛋白萃取条件的响应曲面优化

藻蓝蛋白具有较高的营养和医用价值,为进一步提高其萃取效率,本研究通过响应曲面(response surface methodology,RSM)的方法,对螺旋藻藻蓝蛋白的萃取条件进行优化.结果表明,萃取时间和萃取温度的交互作用对藻蓝蛋白得率的影响最为显著;而实验所得模型的拟合性较好(R2=0.955 0),得到的最佳萃取工艺条件为:质量浓度为2.0mg/mL、萃取时间为37.14h、萃取温度为25.61℃,在此萃取条件下得到的藻蓝蛋白得率为13.66%,较优化前提高了32.8%,与模型预测值13.72%接近.     

钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究

为发展新型海洋药物,采用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品。测定了藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量。藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为２７８,３６０,６２０ｎｍ。得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为ｐＨ＝４．３。还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱。研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品。     

蓝隐藻藻蓝蛋白的分离、纯化及性质研究

以实验室培养的蓝隐藻(Chroomonas placoidea)为材料,经过压力破碎和高速离心分离去除膜成分,得到的上清液分别采用50%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀.沉淀经2次葡聚糖Sephadex G-100层析,得到了纯化的藻蓝蛋白,并对各级藻蓝蛋白的吸收光谱、荧光谱、亚基组成进行了分析.结果显示,隐藻藻胆蛋白呈现出很宽的硫铵沉淀范围,但各种沉淀样品具有几乎相同的光谱特性和相似的亚基组成,说明其不同的水溶性质可能与其亚基聚合程度不同有关;得到的藻蓝蛋白经HPLC和中性PAGE检测,基本不含杂质,A645/A280比值最高可达7以上.结果为今后的研究和应用奠定了基础.     

混合异养螺旋藻中藻蓝蛋白的分离和纯化

为了从螺旋藻中分离和纯化藻蓝蛋白,研究了一种采用硫铵分步盐析,离子交换层析和凝胶过滤层析的分离纯化方法,在硫酸铵分步盐析中,通过对沉淀物的吸收光谱扫描发现,３００ｇ／Ｌ的硫酸铵溶溶能很好除去杂蛋白,而５００ｇ／Ｌ和６５０ｇ／Ｌ的硫酸铵溶液能较好离ｃ－蓝蓝蛋白和别藻蓝蛋白。     

R-藻蓝蛋白的分离纯化及抗食物过敏活性研究

为探究R-藻蓝蛋白抗过敏功效,以坛紫菜为原料,通过25%～35%硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 HR两步柱层析获得了高纯度的目的蛋白(A620/A280>6.0).SDS-PAGE显示,该蛋白质由分子质量为17.7 ku和20.5 ku的两个亚基组成,紫外可见分光光度法测得其在620 nm、555 nm有两个特征吸收峰,可确认其为R-藻蓝蛋白.热稳定性和pH值稳定性实验结果显示,R-藻蓝蛋白在低于35℃、pH=4.0～9.0条件下光谱性质相对稳定.动物实验结果表明,100μg/mL高纯度R-藻蓝蛋白能够显著降低小鼠血清中IgE水平;细胞实验结果表明,40μg/mL R-藻蓝蛋白能够降低细胞因子IL-4、IL-13的蛋白质分泌量;基因表达量分析结果显示,R-藻蓝蛋白能够降低IL-4在淋巴细胞中的表达量.可见,坛紫菜R-藻蓝蛋白通过促使CD4+T cell向TH1型转化发挥抗食物过敏活性.     

海生红藻R-藻红蛋白和隐藻藻蓝蛋白光吸收系数测定

选用Bradford法和Lowry法,以牛血清蛋白和γ-球蛋白作为标准蛋白,分别对从海生红藻异管藻（Heterosiphonia japonica）和多管藻（Polysiphonia urceolata）以及蓝隐藻（Chroomonas placoidea）中分离纯化的异管藻R-藻红蛋白（HR-PE）、多管藻R-藻红蛋白（PR-PE）、蓝隐藻藻蓝蛋白（Cr-PC）进行了蛋白浓度及其特征吸收峰的光吸收系数测定.根据2种方法和2种蛋白针对3种藻胆蛋白的测定结果以及影响结果的主要因素进行了细致地分析和比较,Lowry法是进行藻胆蛋白,尤其是六聚体藻红蛋白浓度及光吸收系数测定的更适合、准确的检测方法;在进行同类或相同藻胆蛋白之间相对含量、比例的定量分析时,Bradford法是一种更便捷的测定方法.由于藻胆蛋白光吸收系数值与选用的蛋白定量检测方法及其所用的标准蛋白直接相关,在使用和比较藻胆蛋白光吸收系数值时必须明确检测方法和标准蛋白,否则藻胆蛋白光吸收系数值将不具有可比性.     

硫酸铵盐析条件对多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白得率和纯度的影响

 藻胆蛋白是一类用途广泛、市场前景广阔的天然色素蛋白,但分离纯化困难。粗提条件优化对最终获得的藻胆蛋白的得率和纯度影响较大。研究了硫酸铵饱和度、盐析次数、分级盐析对海洋红藻多管藻R-藻红蛋白（RPE）和R-藻蓝蛋白（RPC）提取得率和纯度的影响。结果表明,多管藻RPE和RPC的得率随硫酸铵饱和度的提高而增加,饱和度为60%时得率最高,分别为91.59%、97.98%。饱和度20%的硫酸铵仍能沉淀47.3%的RPE和24.8%的RPC。RPE的纯度随硫酸铵饱和度的提高而降低,但RPC纯度随硫酸铵饱和度的提高而增加,至饱和度为45%时纯度最高,之后随饱和度的提高而缓慢降低。饱和度<40%时,RPE/RPC得率比随硫酸铵饱和度提高而增加;饱和度>40%时,RPE/RPC得率比趋于稳定。硫酸铵盐析2次与盐析1次相比,RPE、RPC的得率降低,但纯度提高。二步法盐析比一步法盐析RPE、RPC的纯度分别提高122.42%、18.67%,但得率降低。因此硫酸铵盐析提取多管藻RPE、RPC时,以饱和度60%为宜,盐析2次,二步法盐析有利于藻胆蛋白纯度的提高,二步法盐析时初次使用的硫酸铵饱和度应<20%。藻胆蛋白盐析条件优化可为藻胆蛋白的进一步分离纯化奠定基础。     

螺旋藻藻蓝蛋白提取及稳定性试验

藻蓝蛋白可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记．本研究用氯化钾溶菌酶法或冻融法破碎螺旋藻细胞壁,盐析,提取藻蓝蛋白,并对其理化特性进行了测定．表明酶法破壁适应于大量藻蓝蛋白制备,冻融法只适应于小量制备．提取率为１３％左右,提取藻蓝蛋白在４０℃以下及ｐＨ４．０～８．５之间表现稳定,４５℃以上有变色现象,荧光性减弱,糖溶液可提高藻蓝蛋白对热的稳定性,光照对藻蓝蛋白影响较小     

藻蓝蛋白裂合酶基因的表达与酶活性研究

为了比较研究层理鞭枝藻藻蓝蛋白裂合酶PcE／F与藻红蓝蛋白裂合／异构酶PecE／F的结构与功能,将藻蓝蛋白裂合酶PcE／F氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行比较,并进行大量表达,将表达的裂合酶PcE／F用于藻蓝胆素(PCB)与藻蓝蛋白α-亚基(α-PC)脱辅基蛋白(PcA)的体外重组,得到天然活性的α-PC,从而表明层理鞭枝藻中pcE／F所编码的蛋白质是α-PC生物合成的裂合酶．     

层理鞭枝藻的藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白α—亚基及其色素肽 …

用紫外可见吸收和圆二色光谱研究了层理鞭枝藻的藻蓝蛋白α－亚基色素肽和藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的可逆光化学,这些研究表明藻蓝蛋白α－亚基色素钛和菏红蓝蛋白α－亚基色素肽分别相应于藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白的辅基色素结构域,藻蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻蓝蛋白α－亚基的相应性质很相似,藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻红蓝蛋白α－ 基的相应性质相似,不过藻红蓝蛋白α－亚基色     

海生红藻多管藻中藻胆蛋白的分离纯化

选用Middle Fine Sephadex G-150(MFG-150)、Fine Sephadex G-150(FG-150)以及Sephacryl S-300(S-300)3种凝胶过滤对富含R-藻红蛋白(R-PE)的多管藻藻胆蛋白提取液进行R-PE、R-藻蓝蛋白(R-PC)和别藻蓝蛋白(AP)的分离,并对所得R-PE、R-PC/AP组分用DEAE Sepharose-Fast Flow离子交换层析做进一步纯化,优化建立了从多管藻藻胆蛋白提取液中同时有效分离纯化R-PE、R-PC和AP 3类藻胆蛋白组分的技术方法.     

蓝隐藻藻蓝蛋白亚基的分离及特性研究

以纯化的蓝隐藻(Chroomonas plaoidea)藻蓝蛋白PC645为材料,经尿素变性、分子筛层析以及SDS-PAGE与IEF电泳技术分离、纯化其2类不同亚基,并测定了亚基的吸收光谱、荧光谱、等电点以及pH耐受性等.结果表明,隐藻PC645异二聚体的亚基结构稳定,8 mol/L尿素处理48 h方可令A_(645)=10的PC645样品变性完全.SDS-PAGE与IEF电泳结果表明,经Sephacryl S-100层析得到的α与β亚基组分达到了完全分离的效果,并证实PC645存在分子质量和等电点均不相同的2种β亚基.光谱分析显示,分离后的α和β亚基依然保持光谱活性,其中β亚基是PC645的660 nm特征荧光发射位点,并且在pH值为4.92的磷酸缓冲液中可保持45 d内光谱形态稳定;而α亚基所含的MBV色基不产生荧光,亚基的pH耐受性以pH值为7左右为最佳.实验结果将为研究藻蓝蛋白的亚基结构、能量传递途径等提供相应理论依据,并为进一步的亚基序列分析奠定了基础.     

水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究

应用水提法分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白后,考察了螺旋藻细胞破碎液的藻液比、盐离子浓度、pH和环境温度等对藻蓝蛋白分离的影响,并对藻蓝蛋白的耐热性能及耐酸碱性能进行了研究.结果表明：用藻液比为5 g/L及50%（NH4）2SO4进行盐析沉淀,提取藻蓝蛋白的收率可达62.4 mg/g藻粉;螺旋藻藻蓝蛋白在常温时保持稳定,在较高温度时稳定性下降;在中性溶液环境时,藻蓝蛋白的稳定性良好,偏酸或偏碱环境均改变螺旋藻藻蓝蛋白的性能.     

多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白的制备及其相对分子质量的测定

以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,通过凝胶过滤层析、离子交换柱层析、凝胶电泳,得到纯度较高的R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白.在SDS-PAGE中,藻红蛋白表现出4个带有发色团的亚基α、β、β'、γ和γ',其相对分子质量分别为1.73×1041,.95×104,3.33×104和3.10×104;藻蓝蛋白则表现出3个带有发色团的亚基,分别是:α、β和β',其相对分子质量为1.75×1042,.13×104和2.62×104.不同相对分子质量的γ亚基和β亚基的发现都有别于先前的报道,这对藻红蛋白和藻蓝蛋白结构的研究提供了有价值的研究结果.选用Superdex-200凝胶柱层析对纯化的藻红蛋白和藻蓝蛋白进行了相对分子质量测定,藻红蛋白相对分子质量为2.4×105,藻蓝蛋白相对分子质量为1.36×105这表明纯化制备的藻红蛋白和藻蓝蛋白分别以六聚体((αβ)3γ(αβ)3)和三聚体((αβ)3)形式存在.     

坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基的表达及鉴定

根据GenBank(AY372218)中的相关序列设计引物,通过PCR的方法从质粒pMD-apcAB中扩增坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),并将其克隆到高效表达外源基因的原核表达质粒pTO-T7.将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对表达产物进行Western-blot和质谱鉴定.结果显示:apcB全长486 bp,表达的坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基(APCβ)为带有原核表达载体T7g10的12个起始氨基酸的融合蛋白,其分子量约为18.0 ku.扫描分析的结果表明,0.5 mmol/L的IPTG在37℃诱导6 h时,APCβ的表达量达到最大,达菌体总蛋白40%以上.Western-blot和质谱鉴定的结果表明获得的融合蛋白为重组坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基.     

极大螺旋藻藻蓝蛋白性质的研究

用凝胶电泳、吸收光谱、荧光光谱、示差扫描量热计（ＤＳＣ）和循环伏安法研究了极大螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｍａｘｉｍａ）藻蓝蛋白的性质，结果表明：该蛋白由大小两个亚基组成，分子量分别为１９ＫＤ和１７ＫＤ。吸收光谱显示，该蛋白在３４８ｎｍ和６２０ｎｍ有吸收峰。其荧光发射峰位于６４６ｎｍ。该蛋白的热变性温度范围在４０℃～５４℃附近。该蛋白的循环伏安扫描曲线显示，当扫描速度为０．１Ｖ／ｓｅｃ时，有一个明显的氧化峰。当扫描速度大于０．２Ｖ／ｓｅｃ时，呈现两个氧化和两个还原峰     

红藻多管藻(Polysiphonia Urceolata)R-藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白吸收系数测定及藻胆体藻胆蛋白组成分析

选用多维层析和非变性PAGE(Native-PAGE),从海生多管藻(Polysiphonia Urceola-ta)藻胆蛋白提取液中制备纯度符合光吸收系数测定要求的藻蓝(R-PC)和别藻蓝(AP)蛋白.选用Bradford和Hartree-Lowry法,用牛血清蛋白和γ-球蛋白作标准蛋白,对R-PC、AP进行蛋白浓度...