tPA Kringle-2结构域基因的合成及其在大肠杆菌中表达

本文用固相磷酸三酯法合成了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)174-262片段(Kringle-2结构域)对应的DNA序列。利用PIN Ⅲ OmpA2表达质粒的信号序列和Plpp-lac启动子在大肠杆菌中表达了tPA Kringle-2。约2/3的表达产物分泌在大肠杆菌的周间质中。经硫酸铵盐析,Lysine-Sepharose亲和层析和FPLC-MONOQ离子交换层析等3步纯化后其氨基酸组成和tPA 174-262片段的组成一致。放射结合分析证明重组表达的tPA Kringle-2具有纤维蛋白结合活性。     

尿激酶对纤维蛋白低亲和性的结构基础——Ⅰ.尿激酶及相关环饼结构域的三维结构预测

根据凝血酶原(Prothrombin)环饼结构域-1(PTK-1)2.8晶体X光衍射结构,用残基置换和构型建造(Modeling)预测了纤溶酶原环饼结构域-1(PGK-1),组织型纤溶酶原激活因子环饼结构域-2(PAK-2)和尿激酶原环饼结构域(UKK)的三维结构。预测的三维结构显示PGK-1具有典型的配体结合部位,PAK-2在结构上不具有和配体结合的典型正电荷中心,但邻近的69位精氨酸残基能和配体的羧基生成离子对。UKK在结构上不能形成和配体结合的正负电荷中心,这可能是尿激酶对纤维蛋白低亲和性的主要原因。     

鸭血纤维蛋白A,B肽的纯化及一级结构

本文证明鸭血纤维蛋白 A,B肽经 Dowex 50w×2离子交换树脂及DEAE-Se-pharos,CL-6B纯化后,用手工 Edman氨基酸顺序降解法测得A肽的一级结构为十五肽:Pyr~1)·Asp·Gly·Lys·Ser·Ser·Phe·Gln·Lys·Glu·Gly·Gly·Gly·Val·Ayg.B肽的一级结构为十八肽:Pyr·Ala·Ser·Thr·Asp·Tyr~2)·Asp·Asp·Glu·Asp·Glu·Ser·Thr·Val.Pro·Glu·Ala·Arg.     

大鼠滤泡纤蛋白溶酶原激活因子及抑制因子的相互作用和调节

本文证明卵巢滤泡分泌两种纤蛋白溶酶原激活因子(即tPA和uPA)和一种抑制因子(PAI),并研究了这些因子的相互作用和调节。实验证明,只有tPA,而不是uPA受促性腺激素调节,并在排卵前达到高峰。PAI主要是由内膜-间质细胞分泌的,也受促性腺激素的调节。PA和PAI的相互结合可完全抑制和部分抑制卵巢细胞PA活性。上述资料提示,滤泡的PA以及PAI间的相互作用可能在排卵机制和维持卵巢的正常生理功能中起重要作用。     

尿激酶(uPA)化学合成抑制剂

胞外蛋白的水解是恶性肿瘤细胞侵袭和转移的必要条件,各种蛋白酶的水解反应降解细胞外基质,破坏细胞/细胞间的联系以适应细胞的迁移。尿激酶型纤溶酶原激活物(尿激酶,urokinase-type plasminogen activator, uPA)激活不具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶原为活性纤溶酶,在保持血流畅通与防止血栓的形成中具有重要的作用。此外,活性尿激酶降解细胞外基质,激活多种基质金属蛋白酶,以适应肿瘤细胞的侵袭、扩散和转移。抑制尿激酶的活性被公认为是抑制癌症转移的有效方法,其中合成小分子uPA抑制剂成为抗癌治疗中的新理念。本文综述了合成uPA抑制剂的研究现状。     

颗粒细胞分泌一种刺激卵母细胞组织型纤蛋白溶酶原激活因子的物质

本工作用颗粒细胞或颗粒细胞培液与卵母细胞一起培养的方法研究了颗粒细胞因子对卵母细胞纤蛋白溶酶原激活因子的影响。结果表明,在FSH作用下,颗粒细胞分泌一种(些)刺激卵母细胞tPA活性的因子。这一发现对了解激素通过颗粒细胞合成中间因子调节卵母细胞tPA活性有重要意义。     

抗活化血小板单克隆抗体与尿激酶杂合分子的纤溶作用

用双功能团试剂将尿激酶(UK)B链和抗人活化血小板α-颗粒膜蛋白GMP-140单克隆抗体(SZ-51)的Fab片段共价偶联。偶联的杂合分子UK-SZ-51保留了原抗体的结合专一性,它在体外的溶栓效率较尿激酶提高约5倍,其溶栓作用对血浆中纤维蛋白原的含量无影响。     

促性腺激素对幼鼠卵巢细胞PAI-1分泌的调节

本文研究结果表明:(1)组成滤泡壁主要成分的膜-间质细胞在排卵前分泌大量纤溶酶原激活因子抑制因子(PAI-1),作为屏障以阻止纤溶酶激活因子(tPA)分泌到滤泡外间质;(2)颗粒细胞只分泌微量PAI-1,却产生大量tPA。膜-间质细胞和颗粒细胞在分泌PAI-1的能力及在对激素反应的表达的动力学变化方面有明显不同;(3)只有成熟的卵丘-卵母细胞复合体才分泌大量PAI-1,因此,PAI-1有可能作为鉴定卵丘-卵母细胞成熟的一个可靠指标。     

中药土鳖虫溶栓成分的分离纯化研究

对土鳖虫水浸醇沉提取物2号样品进行了离子交换柱层析，得组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。实验结果表明，组分Ⅲ的溶栓活性明显高于组分Ⅰ和组分Ⅱ，其蛋白质占量为88．9％，分子量约为38，018，效价为313UK／mg，比活力为352UK／mg蛋白。将组分Ⅲ再进行凝胶过滤柱层析，得组分Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。组分Ⅵ的生物活性高于组分Ⅳ和组分Ⅴ，蛋白质含量为89．3％，电泳呈现两条带，分子量约为34，623和39，811，效价为77UK／mg，比活力为86UK／mg蛋白。将组分Ⅵ进行反相高效液相色谱柱层析，收集保留时间为17min的洗脱峰，得到土鳖虫纯蛋白质，呈白色絮状，极易溶于水。再一次用反相高效液相色谱检查其纯度，保留时间为17．073min．无杂质峰。纤溶活性实验结果表明，组分Ⅵ既有直接降解纤维蛋白的作用，同时也有纤溶酶原激活剂样作用。     

血管介入治疗急性脑梗死的疗效及对纤溶性水平的影响

目的探讨血管介入治疗急性脑梗死的临床疗效以及对纤溶性水平的影响。方法选择2012年12月—2013年12月锦州市中心医院收治的急性脑梗死患者100例,随机分为观察组与对照组,各50例,对观察组患者采用血管介入治疗即脑血管球囊成形支架置入术,对对照组患者采用常规治疗方法即低分子肝素钠治疗,对比两组患者的治疗效果,比较观察组、对照组治疗前后的纤溶性水平情况。结果在对两组患者进行分组治疗后,两组患者的临床症状都有所改善,但是观察组患者临床症状改善情况明显优于对照组患者的改善情况,并且在对两组患者的血浆血管性假血友病因子(vWF)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的水平变化观察后发现,观察组患者的vWF水平和tPA水平明显高于对照组患者,但是观察组患者的PAI-1水平明显低于对照组患者,两组数据有明显差异,具有统计学意义,P0.05。结论采用血管介入治疗急性脑梗死患者能够有效改善患者的临床症状,并且患者体内的纤溶性水平明显升高,对急性脑梗死的临床治疗有重要意义,值得临床推广。     

我国产绿臭蛙的皮肤中一个新的速激肽——绿臭蛙激肽的分离和结构

本文利用Sep—Pak C_(13)和HPLC,从我国产绿臭蛙的皮肤甲醇提取物中分离到一个新的14肽——绿臭蛙激肽。此肽结构经分析定为:Asp—Asp—Ala—Ser—Asp—Arg—Ala—Lys—Lys—Phe—Tyr—Gly—Leu—Met—NH_2,且为化学合成所证明。此肽是两栖动物速激肽中最长的一个,其N-端氨基酸与速激肽类其它肽的相应部分有很大区别。此外,简要讨论了纯化过程中绿臭蛙激呔亚砜的形成及其色谱峰的分裂。     

溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达

将抗栓肽(Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原(scuPA-32k)上,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子.利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构,证明其活性区可以正常发挥功能.根据大肠杆菌偏好密码子合成Decorsin的基因,与scuPA-32k基因融合在一起,构建新的嵌合体基因dscuPA,并在大肠杆菌中通过IPTG进行诱导表达,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在.对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质.用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为92000IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似,且有较强的抑制血小板聚集的功能.重组蛋白dscuPA不但具有较强的溶栓功能,而且具有抗栓功能.     

hCG和GnRHa诱发去垂体大鼠排卵及卵巢PA活性变化的比较研究

促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)能诱导去垂体大鼠排卵,与hCG相比,所诱导出的排卵时间提前2-4h.GnRH拮抗物能完全阻断GnRHa和hCG不是作用在同一受体部位上.GnRHa也同hCG一样,只增加卵巢中组织型纤蛋白溶酶原激活因子(tPA)活性,而对尿激酶型PA(uPA)无明显影响.由hCG和GnRHa所诱导的卵巢tPA活性皆在排卵前达到高峰;GnRHa也能刺激卵丘-卵母细胞复合体中tPA活性;注射hCG明显增加血清孕酮水平,而GnRHa对血清孕酮含量没有明显影响.实验说明,GnRHa和hCG诱导排卵可能都是通过增加卵巢中tPA的活性这一共同途径而实现的.     

慈菇蛋白酶抑制剂的抑制特性及其活性中心的探讨

本文采用亲和层析分离纯化了结晶慈菇蛋白酶抑制剂A和B,抑制剂A和B均为双头多功能蛋白酶抑制剂,抑制剂A能同时等当量抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,对激肽释放酶的抑制作用较弱,抑制剂B能当量抑制2克分子的胰蛋白酶,对激肽释放酶的抑制活力高于抑制剂A,但对胰凝乳蛋白酶的抑制作用远比抑制剂A弱。化学修饰以及胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶对抑制剂A的竞争性结合表明:抑制剂A和B的两个活性中心均为Lys和Arg残基,其中Lys活性中心专一抑制胰蛋白酶,而由Arg活性中心构成的活性区域则表现为多功能,能抑制多种蛋白酶,从抑制剂A和B的结构特征推测,两活性中心应分别为Lys-Ser(44—45)及Arg-Tyr-Lys(76—78),在抑制剂A中还存在一疏水性残基参与对胰凝乳蛋白酶的抑制,此残基位于由Arg活性中心所构成的活性区域中。     

应用部分保护肽片段的硫酯合成c-Myb蛋白(38—89)-NH_2

本文研究了应用4-甲基苄基氯选择性保护肽片段中的半胱氨酸巯基,用部分保护肽片段的硫酯合成了c-Myb蛋白(38—89)-NH_2,由4-甲基苄基保护的巯基在硫酯的银离子活化条件下很稳定,该方法可用于含半胱氨酸蛋白质的化学合成。     

脯氨酸的双功能催化作用对制备光学活性环型羟酮的机理 研究

2-甲基-2-乙酰乙基-1,3-环戊二酮(1),在双功能催化剂L-(-)-脯氨酸的作用下,生成(+)-cis-9S-羟基-8S-甲基氢茚-1,5-二酮[(+)-2],化学产率100%,光学纯度93.4%e.e.;而在L-(+)-高脯氨酸的作用下,得到的是(-)-2,产率73%,光学纯度65%e.e..加一方面,3R-(醛丙硫基)-4-硫杂环已酮可差向异构的衍生物(7)分别在D-或L-脯氨酸催化下,所得到的都是呈右旋光性的非对映立体异构的产物(+)-cis-1,8-二硫杂-4R-羟基-9R,10R-十氢萘-5-酮[(+)-8],但从D-脯氨酸得出的光学纯度高得多,这些实验事实和反应机理均可以通过构象分析结合立体结构式得到合理的表达和解释。     

中国蛇岛蝮蛇毒蛋白的电泳结合串联质谱法分析

采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对中国辽宁蛇岛蝮(Gloydius shedaoensis)蛇毒(GSSV)进行分离,染色结果显示该蛇毒中含有多种相对分子质量为12 ～85 ku的蛋白组分.凝胶上切割的蛋白带经胶内二硫苏糖醇(DTT)还原和碘乙酰胺(IAM)修饰后进行胰蛋白酶水解,所得肽段采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-nESI MS/MS)进行分析,蛋白鉴定采用Sequest Bioworks软件搜索NCBInr数据库完成.从GSSV中鉴定出超过25种蛋白组分,主要包括:酸性磷脂酶A2、碱性磷脂酶A2、神经生长因子、突触前神经毒素、出血因子、类凝血酶、丝氨酸蛋白酶、糖原合酶、金属蛋白酶、成熟酶、L-氨基酸氧化酶、纤溶酶源激活物、外源凝集素、富含半胱氨酸分泌酶、去整合素、纤连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原凝固抑制因子A、血管凋亡诱导蛋白1、氨甲酰基磷酸合成酶、吡喃糖-2-氧化酶以及ablomin,catrin,mucrofirase,pallabin,salmosin和triflin的同源蛋白.     

多肽与花粉钙调素的相互作用及对细胞功能的影响

研究了在Ca²⁺存在下,丹磺酰标记的花粉钙调素(D-pCaM)与合成的多肽相互作用的规律.研究结果表明,被研究的绝大多数多肽能与D-pCaM结合而形成复合物,使D-pCaM的荧光光谱发生变化.用荧光法测定了这些复合物的解离常数K_d,其中肽BP-13的Kd值为4.0nmol/L,是与pCaM结合能力最强的一个多肽.除证明了多肽的疏水性,预测二级结构形成倾向和链长对其与pCaM结合能力有影响外,还发现用D-丙氨酸取代肽链中的Gly或L-丙氨酸后,可改变肽对pCaM的亲和性,这为提高多肽与钙调素的亲和力提供了一条改进的途径.我们的研究还可以定性地说明不同来源CaM性质相似又有差异,反映了它们的高度保守性和变异性.同时还展示了所研究的多肽对细胞信息传导过程的影响,为研究CaM对细胞功能调节的作用机制和建立pCaM拮抗肽的活性筛选模型提供了思路.     

促红细胞生成素B螺旋表面肽的代谢稳定性结构修饰：设计、合成及其提高的肾保护作用

肾脏缺血缺氧以及再灌注过程都将导致肾小管上皮细胞凋亡,使肾功能严重受损.肾脏的缺血再灌注损伤是移植肾功能延迟恢复的主要原因并能诱导急慢性排斥,影响肾存活率.近年来发现,衍生于促红细胞生成素（EPO）的B螺旋亚基亲水表面序列的肽链（HBSP）,对肾脏缺血再灌注损伤具有显著的保护作用,但其在体内极短的半衰期（约2min）极大地限制了它的临床应用.因此,本研究采用构象约束、全D-构型氨基酸替换和N-端封闭策略,设计了3种类型的EPOB螺旋表面肽衍生物,旨在提高其代谢稳定性环肽的设计采用了对氧化还原稳定的硫醚键和相对刚性的亚砜键两种环合方式.在多肽的合成上,采用微波辅助多肽自动合成和手工合成两种模式有机结合;优化了硫醚环合工艺,应用微波加热进行硫醚环肽的合成,大大提高了产率和效率;利用圆二色（CD）谱确定了亚砜环肽的相对构型.活性实验表明,相对于线性母肽HBSP,本文设计合成的代谢稳定衍生肽对大/小鼠肾脏缺血再灌注损伤均有显著提高的保护作用,且硫醚和R-构型亚砜环肽的肾脏保护活性强于S-构型亚砜环肽.而且,环化确实提高了功能肽的血浆稳定性.因此,本文合成的硫醚环肽一周一次注射剂量等效于线性肽HBSP一日三次剂量对小鼠肾损伤的保护作用.     

着床过程中兔胚泡小分子肽的分离、鉴定及其有关着床机理的生理意义

本文用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离到妊娠兔子宫液中小分子肽类物质,它们的分子量大约为3000,4500,和6000左右,这类小分子肽在非孕和假孕兔的子宫液中不存在。同样,从妊娠4—6 d的胚泡液亦分离到这类小分子肽。这类小分子肽的等电点在pH4.0—5.5范围内,在亲和电泳中与伴刀豆球蛋白(Con A)有特异结合,由此可知是一类糖肽。此外,LH-RH A对此类小分子肽的合成有抑制作用,本文初步讨论了这类小分子肽在着床过程中的生理功能。