荧光寿命成象显微技术及其应用

本文综述了荧光寿命成象显微技术的概念、原理及实现方法,介绍了荧光寿命成象显微技术在生物物理、生物化学及临床医学诊断等领域的最新研究成果和发展现状,并就其未来的发展及应用研究进行了讨论.     

小波变换在CCD图像边缘检测中的应用

对于CCD图像的非稳定高斯噪声,传统的Fourier变换法无法消除噪声,而小波变换在时域和频域同时具有优良的局部化特征,而且对高频采用逐渐精细的时域或空城步长可以聚焦到分析对象的任意细节,从而克服了传统Fourier变换固定步长等缺点,因此,小波变换法可消除这种噪声.本文在分析CCD图像噪声的基础上,利用小波变换和直方图分割方法对目标图像进行了降噪和边缘检测.试验证明此法行之有效.     

荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展

由于荧光寿命不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响,荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)在监测微环境变化、反映分子间相互作用方面具有高特异性、高灵敏度、可定量测量等优点,近年来已被广泛应用于生物医学等领域.然而,尽管FLIM的发明和发展已历经数十年时间,其在实际应用中仍然面临着许多挑战.例如,其成像分辨率受衍射极限限制,而其成像速度与成像质量和寿命测量精度则存在相互制约的关系.近几年来,相关硬件和软件的快速发展及其与其他光学技术的结合,极大地推动了FLIM技术及其应用的新发展.本文简要介绍了基于时域和频域的不同寿命探测方法的FLIM技术的基本原理及特点,在此基础上概述了该技术的最新研究进展,包括其成像性能的提升和在生物医学应用中的研究现状,详细阐述了近几年来研究者们通过硬件和软件算法的改进以及与自适应光学、超分辨成像技术等新型光学技术的结合来提升FLIM的成像速度、寿命测量精度、成像质量和空间分辨率等方面所做的努力,以及FLIM在生物医学基础研究、疾病诊断与治疗、纳米材料的生物医学研究等方面的应用,最后对其未来发展趋势进行了展望.     

时域两维荧光寿命显微测量研究

提出了一种新的时域两维荧光寿命显微测量技术,建立了一套荧光寿命成像显微系统,介绍了这种测量技术的数据处理方法。用标准样品对该系统进行了测试,实验表明,该系统的时间分辨率为2ps,在放大倍率为100倍的情况下,该系统的空间分辨率为8um。如果在现有的设备下采用更细的网格板和微位移系统,那么该系统的空间分辨率可小于1um.     

图像跟踪中的边缘检测技术

为提高电视图像跟踪系统的图像检测精度,实现对目标的稳定跟踪,研究一种有效、实时的图像检测方法非常必要。本文介绍了边缘检测技术的基本原理,描述了几种边缘检测方法,如传统的基于经典微分算子的边缘检测、LOG滤波器与Marr Hildreth边缘检测算子、多灰度图像边缘聚焦法、Canny边缘检测算子、基于梯度信息的自适应平滑滤波和基于小波的边缘检测算子等。给出了边缘检测技术在实际图像跟踪中的应用实例,指出实际的电视图像跟踪系统可以根据不同的图像类型,考虑安全性、稳定性、精度噪声等因素,选择最优的边缘检测方法。     

单组分荧光寿命成象显微的研究

激发光的调制频率和CCD所记录到的光强度是影响荧光寿命成象显微频域法测量和数据处理精度的主要因素.本文采用Monte Carlo方法,以单组分问题为例,研究了在用频域外差法进行荧光寿命成象显微测量中激发光的调制频率以及CCD所记录到的光强度对数据处理精度的影响,给出了当调制频率不变时,在不同荧光强度下,对于不同的荧光寿命范围、荧光寿命计算的统计结果,给出了改进测量精度的方法.     

荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展

细胞是动植物结构和生命活动的基本单位.细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系.然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用.光学技术的快速发展,为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命...     

彩色图像边缘检测及其在图像融合中的应用

提出了一种新的基于小波变换的彩色图像边缘检测方法,运用噪声和微弱边缘的识别以及动态双域值的选取,使得检测出来的边缘定位精度高,抑制噪声性能好。利用基于区域特征的信息融合策略,比较待融合图像的边缘点的值和区域能量特征值,选择特征突出者对应的原始图像区域组成融合结果。实验结果表明,该算法可以良好地保留两幅图像的细节信息,得到高质量的融合图像。     

荧光寿命数据的相量分析及其应用

荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)具有特异性强、灵敏度高、可定量测量等优点,被广泛应用于生物医学、材料学等领域的研究.为使FLIM技术更好地适用于高通量数据的快速分析,近年来涌现出多种荧光寿命分析的新算法.其中,相量分析法(phasor analysis, PA)通过将时间域的拟合转化为频率域的直接计算来获得荧光寿命值,与传统的最小二乘拟合法相比,不仅更加简便快速,适用于低光子数情形,而且便于使数据内容可视化和对数据进行聚类分析,因此越来越受到科研人员的青睐.本文详细阐述了相量分析法的基本原理及运用方法,并在此基础上介绍了该方法在细胞代谢状态测量、蛋白质相互作用研究、细胞微环境测量,以及辅助病理诊断和提高超分辨成像分辨率等方面的应用,着重讨论了PA法在这些FLIM应用实例中的优势所在,为相关领域的研究提供有益的参考.最后,对荧光寿命数据的相量分析及其应用的发展方向进行展望.     

亚像元边缘检测系统的FPGA实现

提出了一种集成于单片FPGA的数字化线阵CCD边缘检测系统。通过对CCD输出图像的边缘灰度梯度分析,利用高斯滤波除噪、边缘检测算法确定其像元级边界,并提出了一种以最小二乘多项式拟合来确定亚像元级边界位置的新算法。整个系统以现场可编程门阵列器件作为核心及数字电路硬件的载体,利用VHDL语言及图形化输入方式在QuartusⅡ7.2软件平台上进行了系统的设计。误差分析及仿真结果表明,该边缘检测系统的分辨率可达到将近六十分之一的像元宽度,可应用于研制高精度CCD光电自准直仪。     

拟威布尔分布密度函数在荧光寿命成像数据分析中的应用

荧光寿命法成像技术(FLIM)是一种非常有效、功能强大且能用来分析复杂生物组织和细胞分子的成像技术。传统的荧光寿命成像的数据分析,按某些具有不同寿命、离散的单参量指数模型来描述荧光衰减过程。在生物组织这样既复杂又不均匀的样品中,虽然多参量指数模型能提供比单参量指数模型对实验数据更好的拟合效果,但是离散多参量的假定往往是随意的。提出了拟威布尔分布密度函数可能是生物荧光分子团衰减动力过程的真实再现,并且通过计算证明,对于某些生化感兴趣的荧光分子团的多槽基面效价测定样品的数据,相对于单参量指数与多参量指数衰减函数有更好的一致性。同时讨论了将该荧光衰减模型应用于荧光寿命成像的前景。     

Wavelength-Resolved 3-Dimensional Fluorescence Lifetime Imaging

We have developed a compact system for wide-field fluorescence imaging, resolved in three spatial dimensions, lifetime and wavelength, that is based on a gated optical intensifier and an all-solid-state diode pumped Cr:LiSAF oscillator-amplifier system. Exploiting spectral separation, the system has been applied to human teeth, obtaining good lifetime contrast between enamel, dentin and caries. Exploiting spectral separation combined with depth resolution, the study of fluorescent microspheres led to an enhancement in both lifetime contrast and lateral resolution.     

用于双光子激发荧光寿命显微成像的高重复频率皮秒扫描相机

建立了一台基于新研制的高重复频率皮秒扫描相机的双光子激发荧光寿命显微成像系统,重点介绍所研制的高重复频率皮秒扫描相机。为了在高时间分辨力的同时扩大时间测量范围,实现大面积两维空间高时间分辨取样测量,从而提高采样速率和更有效地发挥扫描相机的作用,设计和研制了一种大面积、高时间分辨力扫描变像管和一种重复频率高达1MHz的斜坡电压扫描电路。基于上述关键部件所研制的扫描相机具有重复频率高、扫描速度可调、时间分辨力高、工作面积大、非线性低、触发晃动小等优点。用钛宝石飞秒激光器作为激光脉冲源,通过脉冲提取器将76MHz的高重复频率降低为1MHz,采用可调延时器和标准具对扫描相机的时间分辨力、扫描速度和非线性进行标定。该系统的时间分辨力达到6.5ps,非线性为2.60%,可测量的时间范围从十几皮秒到几十纳秒。测量了若丹明6G和香豆素314两种标准荧光染料的荧光寿命,取得了与参考文献一致的实验结果。     

Fluorescence lifetime imaging in biosciences: technologies and applications

The biosciences require the development of methods that allow a non-invasive and rapid investigation of biological systems. In this aspect, high-end imaging techniques allow intravital microscopy in real-time, providing information on a molecular basis. Far-field fluorescence imaging techniques are some of the most adequate methods for such investigations. However, there are great differences between the common fluorescence imaging techniques, i.e., wide-field, confocal one-photon and two-photon microscopy, as far as their applicability in diverse bioscientific research areas is concerned. In the first part of this work, we briefly compare these techniques. Standard methods used in the biosciences, i.e., steady-state techniques based on the analysis of the total fluorescence signal originating from the sample, can successfully be employed in the study of cell, tissue and organ morphology as well as in monitoring the macroscopic tissue function. However, they are mostly inadequate for the quantitative investigation of the cellular function at the molecular level. The intrinsic disadvantages of steady-state techniques are countered by using time-resolved techniques. Among these fluorescence lifetime imaging (FLIM) is currently the most common. Different FLIM principles as well as applications of particular relevance for the biosciences, especially for fast intravital studies are discussed in this work.      

不同荧光波长的双光子共焦成像分析

研究了双光子共焦显微镜中不同荧光波长对成像特性的影响,导出了不同荧光波长的三维脉冲响应函数和三维光学传递函数并进行数值计算.研究结果表明：不同荧光波长对双光子共焦显微镜的三维光学传递函数、三维脉冲响应函数和空间截止频率产生明显的影响,随着荧光波长的增大,分辨率明显下降,但不会出现单光子共焦显微镜中的失锥现象,选取适当的荧光波长进行成像,有利于进一步改善图像分辨率和成像质量.     

Chemical Imaging of Phase-Separated Polymer Blends by Fluorescence Microscopy

Blends of poly(vinylacetate) (PVAc) and poly(cyclohexylmethacrylate) (PCHMA) labeled by copolymerization with 4-methacryloylamine-4-nitrostilbene (Sb), with (1-pyrenylmethyl)methacrylate (Py), or with 3-(methacryloylamine)propyl-N-carbazole (Cbz) were prepared by casting dilute solutions in tetrahydrofurane (THF) or chloroform. Films about 10 m thick were formed. Phase separation in two types of domains is observed by transmission optical microscopy (TOM) and epifluorescence microscopy (EFM): small craters of 1 to 10 m placed at the polymer-air interface and larger domains, on the scale of 100 m. The morphology of samples depends on the composition of the polymer blend and on solvent. The green fluorescence of Sb, the violet of Py, or the blue of Cbz provides imaging of the distribution of PCHMA in the different domains and in the matrix. It is thus observed that (i) superficial craters and large domains are formed mainly by PCHMA and (ii) the matrix is composed of PVAc in films cast from THF and it is a blend of the two polymers, homogeneous at the submicrometric scale, for chloroform. The emission intensity of Py, recorded by microfluorescence spectroscopy (MFS), yields a mapping similar to imaging detection. It is remarkable that in films cast from chloroform, the smaller domains are distributed with a 2D hexatic order disrupted by dislocations and disclinations, whereas in films cast from THF, a larger heterogeneity is found, denoting different mechanisms of solvent evaporation.     

多光谱荧光图像技术检测农药残留

多光谱成像技术是一种结合传统的二维成像技术及光谱技术的新兴无损检测技术。本文利用有机磷农药的荧光特性,结合多光谱成像技术和荧光激发技术,研发了叶片农药残留快速检测的多光谱荧光成像系统。结果表明,在190~300 nm的紫外光激励下,配置好的有机磷农药氧乐果会在440 nm附近产生显著的荧光发射,并且荧光发射光谱峰值与农药浓度具有良好的线性关系。滤光片可置换的多光谱成像系统研发以及实验检测结果为开发实时在线的农药残留快速无损检测系统提供了技术保障和理论依据。