小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以总DNA为模板，采用PCR技术克隆得到运动发酵单胞菌(Zymamonas mobilis）丙酮酸脱羧酶(pyru—Vate decarboxylase)基因pdc，将该基因连接到表达裁体pSE380上，得到重组质粒PSE—pdc,将此重组质粒转化到受体菌E．coliDH5α中，挑取重组菌株．经IPTG诱导后，在乙醛指示平板检测到丙酮酸脱羧酶活性．SDS—PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带：其分子量约为60KD．     

大肠杆菌高效表达载体pSY621的构建

基因在大肠杆菌中的表达往往受转录起始区的二级结构所影响,通过改变原有载体ｐＳＹ６００的ＴＩＲ区域的序列,来改造出一个能高效表达的载体ｐＳＹ６２１。在表达载体上接入ＡＮＧ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）,ＮＴ４（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－４）基因,由ＰＣＧＥＮＥ软件来计算二级结构和自由能,设计修改片段,产生新载体ｐＳＹ６２１。通过表达ＡＮＧ,ＮＴ４,ｐＺＰ３（ｐｉｇ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ）基因来检测     

兔脑组织因子基因在大肠杆菌中的克隆与表达

重组组织因子(recombinant tissue factor,rTF)是新一代凝血酶原时间检测(PT)试剂的主要成分.从新鲜兔脑组织提取总RNA,通过RT-PCR得到TF全长编码基因,并克隆到pMD19-T载体.以测序验证正确的重组子为模板,扩增TF基因并构建成融合表达质粒pMAL-c2X-TF,并将其转化到DH5α中.SDS-PAGE和Western blotting证明,菌体诱导后形成可溶性的融合表达产物,该融合蛋白通过亲和层析纯化和凝血因子X a水解成为游离的TF蛋白,该蛋白通过脂化,制备成重组PT试剂.凝血试验表明,该试剂对血浆有明显的促凝活性.     

抗菌肽A-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与初步分泌表达

采用 Ｅｃｏ Ｒ Ⅰ和 Ｂａｍ Ｈ Ⅰ接头将化学合成的大小为４５ 对碱基的 Ｃ Ａ（１ － ７） Ｍ（５ － １２） 杂合肽基因克隆到 Ｅ．ｃｏｌｉ 分泌表达载体ｐ Ｉ Ｎ－ Ⅲ· Ｏｍｐ Ａ２ 上的 Ｅｃｏ ＲⅠ－ Ｂａｍ ＨⅠ位点之间,并对其在 Ｌｐｐ启动子和 Ｌａｃ 启动子／ 操纵子调控下的分泌表达进行初步研究重组子的地高辛（ Ｄｉｇ） 核酸探针杂交和酶切分析结果表明杂合肽基因克隆成功;抑菌活性的检测结果表明杂合肽基因表达产物有一定的抑菌活性     

大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物，进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因(NADP-specific glutamate dehydrogenase，gdhA gene)，将所得DNA片断连接到质粒pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选和酶切鉴定，经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和双波长扫描分析，确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在，未能检测到可溶性蛋白的表达，表达量可达菌体总蛋白的15％以上．     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

中性蛋白酶基因的克隆与表达载体的构建

中性蛋白酶是指其最适作用pH为6－7．5的一类蛋白酶，其主要作用为皮革脱毛、毛皮软化、制蛋白胨、 酵母膏、肝宁及用于食品工业等。我们从枯草杆菌中克隆出中性蛋白酶基因，并成功构建了中性蛋白酶基因表达载体，为下一步实现蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

枯草杆菌启动基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以大肠杆菌启动基因选择载体pHE5为载体,枯草杆菌染色体DNA为供体,克隆了一批启动基因功能片段,带克隆片段的重组质粒在大肠杆菌中表现不同的四环素抗性水平,其中50%在100μg/ml以上,12%达到200μg/ml。对其中一个转化子进行质粒检测和分析,获得一个重组质粒pHE273,经酶切分析证明,克隆的强启动基因位于2.2kb的EcoRI-HindⅢ片段上。     

大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达

以大肠杆菌XL1blue为模板，通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因，并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上，构建重组质粒．重组质粒pTrcHisC-TRX在大肠杆菌中高效表达，最后利用固定化金属螫合亲和层析技术(IMAC)获得较纯的目的蛋白，为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件．     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY）,扩增产物大小为2．2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。     

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以E.coli MC4100染色体DNA为模板使用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC，该基因全长1044bp，编码相对分子质量为37ku的蛋白质。将该基因直接克隆于PET—16b质粒的T7启动于下游，得到质粒pEXP1。转化E．coli BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80-85倍。     

血管内皮抑素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

血管内皮抑素不仅能特异性地抑制血管内皮生长，而且对血管形成和肿瘤生长也具有强烈的抑制作用。利用PCR法从人胎肝cDNA文库中克隆了人血管内皮抑素的编码序列，构建了重组质粒pRSendo，并在E.coli中表达，SDS－PAGE表明其表达产物为包涵体，此外，还对血管内皮抑素做了初步的纯化。     

蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中的克隆与表达

根据蚯蚓纤溶酶最佳组分的N-末端氨基酸序列设计简并引物,以蚯蚓cDNA为模板,获得该组分蛋白质的部分编码序列(AF432224,GenBank 登陆号).BLAST相似性分析表明,该序列与U25643和U25648的部分序列相似性达91%, 根据5' 和3' 末端保守序列设计引物,经PCR获得全长cDNA编码序列.将该序列插入pTBY-11质粒,转化大肠杆菌,表达蛋白以包含体形式存在.     

美洲拟鲽(Pseudopleuronectes americanus)抗冻肽基因在大肠杆菌中的表达

将美洲拟鲽抗冻肽基因克隆于原核高效表达载体ｐＫＫ２２３－３中,经酶切分析、ＰＣＲ检测筛选出重组克隆ｐＭＫ１１,转化大肠杆菌ＪＭ１０９和ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导２～３ｈ后,超声波裂解细菌产物,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图谱分子量９ｋＤａ处显示出一条明显的蛋白带,与美洲拟鲽抗冻肽大小一致,表明美洲拟鲽抗冻肽基因在大肠杆菌中表达,为进一步研究抗冻肽基因在大肠杆菌中的表达水平及条件打下基础．     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。