微球透镜超分辨显微成像与检测技术综述

受衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率最高约为波长的一半,突破衍射极限,获得更高的成像分辨率是近年来显微成像领域的研究热点。相比于其他超分辨显微成像方式,基于微球透镜的超分辨显微成像方式具有简单直接、免标记等优点。主要介绍国内外研究团队将微球与传统的光学显微镜结合实现超分辨显微成像的研究进展,从微球透镜参数选择、成像方案、成像分辨率、成像视场及成像机理等多角度进行总结与比对;并结合课题组工作,介绍了将微球透镜与干涉显微技术相结合的三维超分辨检测技术,阐述了Linnik型与Mirau型两种检测光路原理,分析了三维超分辨检测的效果;展望了微球透镜超分辨显微技术在显微成像与显微干涉检测两个方面待解决的问题与发展方向。     

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.     

光学移频超分辨成像技术进展

光学显微镜具有无损、样品友好、速度快等优点,一直是人类探索微观世界的主要手段。但是,由于受到衍射极限限制,长期以来,光学成像系统的分辨率最高仅能达到可见光半波长量级,逐渐成为科学技术发展的桎梏。对于荧光标记样品,可以利用荧光超分辨光学显微成像技术打破光学衍射极限,填补电子显微镜(约为1 nm)和普通可见光学显微镜(200~250 nm)之间的空缺。然而,对于大多数样品特别是非荧光标记样品而言,利用现有技术进行超分辨成像依旧存在相当难度。近年来,科研人员从合成孔径成像原理出发,提出了光学移频超分辨成像方法,开辟了光学超分辨成像的新思路。光学移频超分辨成像不拘泥于荧光非线性效应的限制,兼具非荧光标记样品以及荧光标记样品的超分辨成像能力,而且因为其成像速度快、样品普适性高和光毒性低等优点,在材料学、生物学和医学等领域展现了很好的应用前景。本文从原理和方法上详细综述了移频超分辨光学显微成像技术,并对未来发展方向进行了评述和展望。     

基于点扫描的超分辨显微成像进展

光学显微镜一直推动着现代科学技术的发展.随着科学的进步,对显微成像分辨率的要求在生物、材料等领域日渐凸显,而常规宽场显微成像一直面临着成像分辨率衍射受限的问题.1968年出现的共聚焦显微镜作为点扫描显微镜的开端第一次实现了远场下成像分辨率的突破,它具有层切性好、信噪比高等优点.在1994年出现的受激辐射荧光损耗显微镜将显微成像能力突破到2.8 nm左右,并成为目前效果最佳、应用较广泛的超分辨显微技术.荧光差分显微和饱和荧光吸收竞争等点扫描技术具有无荧光染剂限制、饱和光强低、光路简单等优势,并且能取得1/6波长的分辨能力,进而在超分辨显微领域仍有着发挥空间.Airyscan技术作为以上方法的补充可以弥补点扫描系统中由于探测小孔半径减小而带来的信号丢失,从而提高成像信噪比和分辨率,但阵列探测器成本较高.上述点扫描显微镜通过改变照明或者探测的方式实现了分辨率突破.本文详细讨论了点扫描超分辨方法的原理、成像效果及面临的瓶颈,并分析了点扫描超分辨显微镜在应用和技术上的趋势.     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

基于近场光学的微球超分辨显微效应

在光学成像领域,由于受到衍射极限的限制,常规成像分辨率在200nm左右.科学的不断进步对更高分辨率有着迫切需求,如何突破这个极限来获得更高质量的高分辨率图像是热门研究领域.2011年提出了微球超显微技术:在原有的光学系统中,将直径几微米至几十微米的透明微球直接置于样品表面,就能够成倍提高传统光学显微镜的成像能力.微球超显微技术以其简单直接的特点,受到广泛关注.本文介绍了光学显微镜的研究背景以及国内外团队在微球超分辨显微技术方面的研究进展,包括通过在微球表面进行环刻同心环、中心遮挡和表面涂覆的方法来调节微球所产生的光子纳米喷射方面所开展的一系列研究,并进行了理论模拟和实验验证,进一步提升了微球的超分辨显微效应.最后,展望了今后微球超分辨显微技术的应用与发展方向.     

基于线性成像系统的光学超分辨显微术回顾

随着纳米科学技术的发展,如何打破光学衍射极限,将光学显微术的分辨本领推进到纳米尺度,已经成为光学领域的一个核心议题.在此背景下,过去的三十年间,发展了多种超分辨光学显微技术,并在生物、材料、化学领域取得了一系列令人瞩目的应用.本文以衍射理论为线索,回顾各类基于线性成像系统的超分辨光学显微技术;对以固浸物镜、结构光照明、扫描近场光学显微术、完美透镜以及超振荡透镜为代表的超分辨光学显微技术进行综述,讨论各种技术的原理,对其特点、应用与局限加以总结,并对该领域的未来发展予以展望.     

超分辨荧光显微成像染料结构与生物应用（特邀）

荧光显微成像技术的生物医学应用离不开荧光染料的设计与开发。有机小分子荧光染料因其易于修饰、生物相容性好、光物理性质优异等特点,在细胞生物成像领域受到了广泛关注。随着超分辨荧光显微镜的发展和技术的进步,使得荧光显微成像突破了光学衍射极限,可以获得更为精准的生物分子学信息,观察纳米尺度下亚细胞器之间的相互作用。根据不同的成像原理,科学家开发出了单分子定位成像技术、受激辐射损耗成像技术、结构光照明技术等超分辨荧光显微技术。这些技术在细胞荧光显微成像领域的应用与发展,同时对有机小分子荧光染料的设计与开发提出了新要求。本文介绍了主流超分辨荧光显微技术的原理,总结已发表的超分辨荧光显微成像荧光染料的结构和光物理性质特点,归纳了其设计要求,旨在为新型荧光染料的设计提供参考。     

基于大数值孔径环形光锥照明的超分辨光学 显微成像方法研究

提出和发展了一种基于大数值孔径环形光锥照明的远场超分辨光学显微成像新方法, 采用将发光二极管(LED)面光源、窄带滤光和环形光锥照明相结合的特种照明方式, 实现超分辨显微成像. 建立了大数值孔径环形光锥照明成像的物理模型, 根据标量衍射理论, 在不同环形光锥照明时, 推导出光学显微系统像面衍射斑光强分布的理论计算公式; 通过Matlab求解和绘图, 得到衍射斑光强的分布图样, 从理论上证明这一成像方法可以有效提高光学显微镜的分辨率; 建立了相应的显微成像系统, 通过实验验证了该方法可有效改善显微镜的成像质量, 显著提高分辨率; 在中心波长450 nm、环形光锥数值孔径1.125—1.25时, 实验获得的分辨率至少优于150 nm, 与理论研究结果相符合, 从而证明了这一方法的可行性.     

基于点扫描结构光的SHG超分辨显微技术研究

二次谐波产生(SHG)成像技术是一种针对非中心对称生物组织的免标记成像技术,已经成为生命科学研究的重要手段。衍射极限使得SHG技术无法分辨衍射极限以下的精细结构。虽然超分辨显微技术取得了突破性进展,但是SHG的相干非线性过程限制了SHG超分辨显微技术的发展。提出了一种点扫描结构光照明SHG超分辨显微(SHG-psSIM)技术,实现了氧化锌颗粒和小鼠尾腱的超分辨SHG显微成像。在传统的SHG显微系统的激发光路中引入电光调制器,通过对激发光正弦调制产生点扫描结构照明图案。基于点扫描结构照明图案与样本结构相互作用产生的莫尔条纹效应,将原本不可探测的样本高频信息搬移到显微镜通频带内,并利用光电倍增管探测。最后,利用软件重构出超分辨率图像。对比传统SHG系统,SHG-psSIM分辨率提高了1.86倍。     

结构光照明超分辨光学显微成像技术与展望

结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy,SIM)通过结构化照明在频率域以空间混频的方式将物体高频信息载入光学系统的探测通带内实现突破衍射极限的超分辨光学显微成像。SIM凭借其较低的激发光强、对荧光染料的非特异性需求以及快速的宽场成像优势已成为活细胞超分辨光学显微成像方面应用最多的技术。本文系统回顾了SIM的技术进展,对SIM的基本原理与实现方法进了详细的分析,重点介绍了本课题组研发的基于光谱分辨的单光子激发超分辨显微镜和结合自适应光学的双光子激发超分辨显微镜这两种最新的SIM技术,最后简要讨论了SIM技术在生物成像中的应用及未来发展方向。     

平面超透镜的远场超衍射极限聚焦和成像研究进展

突破瑞利衍射极限,实现纯光学的远场超衍射极限聚焦和成像在科学和工程的各个领域都有重要意义.现有光学超分辨技术都存在一些固有的限制因素,如工作距离短、适用领域窄、不利于集成等问题.平面超透镜由于理论上的创新、设计灵活、效率高、方便集成等优势,成为实现超衍射极限的有效途径.本文综述了平面超透镜的物理原理及其在超衍射极限聚焦和成像方面近年来的研究进展,并讨论了该领域面临的问题和未来的研究重点和方向.     

光学超振荡与超振荡光学器件

传统光学器件的衍射极限极大地制约了远场超分辨光学系统的进一步发展.如何从光学器件层面突破光学衍射极限瓶颈,实现非标记远场超分辨光学成像,是光学领域面临的巨大挑战.光学超振荡在不依靠倏逝波的条件下,可以在远场实现任意小的亚波长光场结构,这为突破光学衍射极限提供了一条崭新的途径.近年来,光学超振荡现象和超振荡光学器件的相关研究得到了快速发展,在理论和实验上成功地演示了超振荡光场的产生和多种超振荡光学器件,并在实验上展示了超振荡光学器件在非标记远场超分辨光学显微、成像以及超高密度数据存储等应用领域的巨大优势和应用潜力.本文对光学超振荡相关理论、超振荡光学器件设计理论和方法、超振荡光学器件发展现状、超振荡光场测试方法以及超振荡光学器件的应用等方面进行详细介绍和分析.     

平场复用多焦点结构光照明超分辨显微成像

多焦点结构光照明显微技术(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50μm的成像深度内和1Hz的成像速度下实现两倍于衍射极限分辨率的提升,相比传统的宽场结构光照明显微技术,具有较大的成像深度和层析能力,更适合应用于厚样品的长时程三维超分辨成像.然而, MSIM存在成像速度慢、图像处理过程复杂等问题.本文提出了一种基于平场复用多焦点结构光照明的快速超分辨显微成像方法和系统(flat-field multiplexed MSIM, FM-MSIM),通过在照明光路中插入光束整形器件,将高斯光束转变为均为分布的平顶光束,提高激发点阵的强度均匀性和扩大视场;通过将每个衍射受限的激发点沿y方向延长,形成新的多路复用多焦点阵照明图案,提高能量利用率,减少扫描步数,进而提高成像速度和信噪比;结合基于多重测量矢量模型的稀疏贝叶斯学习图像重构算法,简化图像重构步骤,在保证空间分辨率的同时实现至少4倍于传统MSIM的成像速度.在此基础上,利用搭建的FM-MSIM系统进行了BSC细胞微管样片和小鼠肾切片标准样片的超分辨成像实验,实验结果证明...     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

超分辨近场结构的研究进展及其应用

超分辨近场结构(super-resolution near-field structure,super-RENS)由于突破了传统远场光学衍射极限的限制,在纳米光储存、微纳米加工、基于局域表面等离子体增强的生物传感器方面展现出良好的应用前景,因此吸引了众多研究者的目光.文章简要介绍了超分辨近场结构的发展历程、相应的工作机理、最新研究动态及其在超高密度光存储、近场光刻中的应用状况,并对未来的工作重点做出展望.     

荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展

由于荧光寿命不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响,荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)在监测微环境变化、反映分子间相互作用方面具有高特异性、高灵敏度、可定量测量等优点,近年来已被广泛应用于生物医学等领域.然而,尽管FLIM的发明和发展已历经数十年时间,其在实际应用中仍然面临着许多挑战.例如,其成像分辨率受衍射极限限制,而其成像速度与成像质量和寿命测量精度则存在相互制约的关系.近几年来,相关硬件和软件的快速发展及其与其他光学技术的结合,极大地推动了FLIM技术及其应用的新发展.本文简要介绍了基于时域和频域的不同寿命探测方法的FLIM技术的基本原理及特点,在此基础上概述了该技术的最新研究进展,包括其成像性能的提升和在生物医学应用中的研究现状,详细阐述了近几年来研究者们通过硬件和软件算法的改进以及与自适应光学、超分辨成像技术等新型光学技术的结合来提升FLIM的成像速度、寿命测量精度、成像质量和空间分辨率等方面所做的努力,以及FLIM在生物医学基础研究、疾病诊断与治疗、纳米材料的生物医学研究等方面的应用,最后对其未来发展趋势进行了展望.