微球透镜超分辨显微成像与检测技术综述

受衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率最高约为波长的一半,突破衍射极限,获得更高的成像分辨率是近年来显微成像领域的研究热点。相比于其他超分辨显微成像方式,基于微球透镜的超分辨显微成像方式具有简单直接、免标记等优点。主要介绍国内外研究团队将微球与传统的光学显微镜结合实现超分辨显微成像的研究进展,从微球透镜参数选择、成像方案、成像分辨率、成像视场及成像机理等多角度进行总结与比对;并结合课题组工作,介绍了将微球透镜与干涉显微技术相结合的三维超分辨检测技术,阐述了Linnik型与Mirau型两种检测光路原理,分析了三维超分辨检测的效果;展望了微球透镜超分辨显微技术在显微成像与显微干涉检测两个方面待解决的问题与发展方向。     

基于一体化微球物镜的超分辨成像系统

利用直径微米量级的透明微球与传统光学显微镜相结合,可以在白光下实现超分辨成像.目前大部分研究是将微球直接播撒到样品表面,由于微球位置的随机性和不连续性导致无法实现特定区域的完整成像,极大限制了该技术的使用范围.使用微探针或微悬臂黏附微球,通过三维位移台精确控制微球位置,一定程度上解决了上述问题,但是需要对微球位置进行精准操控.本文提出了一种结构稳定、参数可控、简单易用的基于一体化微球物镜的超分辨成像系统,对微球与物镜进行了一体化安装设计,通过设计侧视成像及位置反馈系统实现了对微球、物镜和样品三者之间距离的精准控制,结合通用的显微成像系统,实现了对可控特定区域的超分辨成像.该系统将普通显微物镜(40×, NA 0.6)的分辨能力提高了4.78倍,最高可以看到100 nm的样品特征.该一体化物镜可以搭配普通光学显微系统使用,实现超分辨成像,提高了微球超分辨技术的通用性,在亚衍射极限样品的超分辨成像方面具有广泛的应用价值.     

随机光学重构显微成像技术及其应用

光学显微成像技术在生命科学、生物医学、临床医学诊断和材料科学等领域有着非常广泛的应用。但由于光学衍射极限的存在,传统光学显微镜无法观察到纳米尺度的物质及生命活动,极大地限制科学研究和医学的发展。近年来,随着突破光学衍射极限的超分辨成像技术的不断发展,显微成像分辨率得到不同程度的提高。目前在基于不同原理的各种超高分辨率显微镜中,随机光学重构显微镜(STORM)分辨率最高,可达几十纳米,真正实现了单分子水平检测。着重介绍了STORM超分辨显微成像技术的原理、实验方法及其应用。     

超分辨成像及超分辨关联显微技术研究进展

光学成像系统中有限孔径对光波的衍射,使得光学显微成像技术的分辨率受到"衍射极限"限制而无法进一步提高.自1873年E.K.Abbe提出该问题以来,衍射极限就一直是学术界研究的热点.近年来,随着高强度激光、高灵敏探测器等光电器件研制技术以及新型荧光探针开发等相关领域的快速发展,光学显微技术衍射极限问题的研究迎来了新的契机,超分辨显微成像技术(super-resolution microscopy.SRM)在近十年内取得了令人瞩目的巨大成就.本文从空域和频域角度回顾了衍射极限分辨率的基本原理,并据此对目前常见的各种SRM技术"绕过"衍射极限提高分辨率的机理给予了详解,同时介绍了各类技术的发展动态和研究方向;作为SRM的一个新的重要的发展趋势,本文详细介绍了超分辨关联显微技术的最新研究进展,包括SRM与活细胞实时荧光显微、荧光寿命显微、光谱测量和成像、电子显微、原子力显微、质谱技术等的关联,着重讨论了各类超分辨关联显微技术的作用和意义;最后,对SRM技术和超分辨关联显微技术的未来发展方向进行了展望.     

超分辨光学成像中的高速高精度图像分析方法

本刊讯光学显微镜的分辨率受到衍射效应的限制。自1873年以来,200nm的“阿贝极限”一直被认为是光学显微镜理论上的分辨率极限。近年,人们在超越衍射极限的成像方法研究中取得了令人瞩目的进展,其中,基于单分子定位的超分辨光学成像技术,获得了高达30～50nm的空间分辨率,为科学研究的诸多领域,尤其是活细胞内动态过程的研究,提供了前所未有的工具。     

光学移频超分辨成像技术进展

光学显微镜具有无损、样品友好、速度快等优点,一直是人类探索微观世界的主要手段。但是,由于受到衍射极限限制,长期以来,光学成像系统的分辨率最高仅能达到可见光半波长量级,逐渐成为科学技术发展的桎梏。对于荧光标记样品,可以利用荧光超分辨光学显微成像技术打破光学衍射极限,填补电子显微镜(约为1 nm)和普通可见光学显微镜(200~250 nm)之间的空缺。然而,对于大多数样品特别是非荧光标记样品而言,利用现有技术进行超分辨成像依旧存在相当难度。近年来,科研人员从合成孔径成像原理出发,提出了光学移频超分辨成像方法,开辟了光学超分辨成像的新思路。光学移频超分辨成像不拘泥于荧光非线性效应的限制,兼具非荧光标记样品以及荧光标记样品的超分辨成像能力,而且因为其成像速度快、样品普适性高和光毒性低等优点,在材料学、生物学和医学等领域展现了很好的应用前景。本文从原理和方法上详细综述了移频超分辨光学显微成像技术,并对未来发展方向进行了评述和展望。     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

微球辅助相移干涉三维形貌测量

相移干涉显微镜在微观物体三维形貌的重构横向分辨率上受衍射极限影响,一般在微米级,限制其应用。将高折射率微球嵌入Mirau型相移干涉显微系统中,利用微球超分辨机理提高了其三维重构横向分辨能力,通过和原子力显微镜的测量对比验证了方法的可行性。仿真分析了微球尺寸对光子纳米喷流效应和超分辨能力的影响;同时使用两种不同尺寸的微球对275nm线宽的标准光栅样品进行了三维形貌重构;结果表明,在两种微球的辅助下,相移干涉显微系统均能够精确还原样品的三维结构,光栅深度测量结果与原子力显微镜结果相当。在微球辅助下,系统的横向分辨能力达到了275nm,相较于不使用微球的情况下提高了2.1倍,微球的最高放大率达到了3.4倍。系统在微纳米测量等领域具有较高的应用价值。     

基于点扫描的超分辨显微成像进展

光学显微镜一直推动着现代科学技术的发展.随着科学的进步,对显微成像分辨率的要求在生物、材料等领域日渐凸显,而常规宽场显微成像一直面临着成像分辨率衍射受限的问题.1968年出现的共聚焦显微镜作为点扫描显微镜的开端第一次实现了远场下成像分辨率的突破,它具有层切性好、信噪比高等优点.在1994年出现的受激辐射荧光损耗显微镜将显微成像能力突破到2.8 nm左右,并成为目前效果最佳、应用较广泛的超分辨显微技术.荧光差分显微和饱和荧光吸收竞争等点扫描技术具有无荧光染剂限制、饱和光强低、光路简单等优势,并且能取得1/6波长的分辨能力,进而在超分辨显微领域仍有着发挥空间.Airyscan技术作为以上方法的补充可以弥补点扫描系统中由于探测小孔半径减小而带来的信号丢失,从而提高成像信噪比和分辨率,但阵列探测器成本较高.上述点扫描显微镜通过改变照明或者探测的方式实现了分辨率突破.本文详细讨论了点扫描超分辨方法的原理、成像效果及面临的瓶颈,并分析了点扫描超分辨显微镜在应用和技术上的趋势.     

受激辐射损耗超分辨显微成像系统研究的新进展

由于受到衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率被限制在半个波长左右.近二十年来出现了许多通过不同方法绕过光学衍射极限的超分辨成像技术,其中,受激辐射损耗显微(stimulated emission depletion microscopy,STED)通过引入一束环形损耗光来抑制荧光光斑外围荧光分子的发光,以达到减小点扩散函数的目的,实现超分辨成像.经过近些年的发展,STED系统无论从光束的产生、校准和扫描,还是最后的成像,都有了很大的发展.本文将简要介绍STED成像技术的基本原理,详述STED超分辨成像技术出现至今在光源、扫描及成像系统等方面的进展,以及在三维成像和多色成像方面的发展现状,STED技术与其他显微技术的结合.最后,本文对STED技术近几年的研究新进展进行了系统的论述,对STED技术未来的发展趋势进行了探讨.     

Modelling and verification of white light oil immersion microsphere optical nanoscope

Microsphere has been demonstrated for imaging resolution improvement based on optical microscope, and applied in many engineering and biological fields successfully, while its mechanism is still inconclusive due to the complex physics of both near-field and far-field optics involved. In this paper, a comprehensive simulation model based on point spread function is built to develop a physical insight into microsphere optical nanoscope by numerical simulation. With this model, the Fresnel-region focusing of microsphere lens is studied, which shows the contradiction between focal spot size and focal length. Furthermore, the gap between microsphere and the sample surface is investigated by numerical simulation and experimental verification. As increasing of this gap, the image resolution declines rapidly, and the image becomes blur more and more. At last, a customized sample with a flower pattern etched on silicon substrate is demonstrated with microsphere optical nanoscope, and its feature sizes of 51 nm line width are imaged clearly. While it is generally accepted that microsphere optical nanoscope can be implemented in nano-imaging, these findings quantified the limit on image resolution of this setup, which serves as a general guideline in system design of the other microsphere or micro-particle assisted microscope/nanoscope.     

样品表面银膜的粗糙度对钛酸钡微球成像性能的影响

研究了样品表面镀有不同表面粗糙度的银膜对钛酸钡（BaTiO₃ glass,BTG）微球成像效果的影响,发现当银膜表面的粗糙度（RMS）从3.23 nm增大到6.80 nm时,用直径为15 μm的BTG微球观察直径为250和580 nm的微球阵列,样品的成像范围增大.另外,BTG微球还可以清晰分辨原本不可分辨的直径为200 nm的微球阵列.结果表明,粗糙银膜引起的散射作用和表面等离激元波的局域场增强效应,使得更多物体的高频信息耦合进微球,提高了微球成像的分辨率和成像范围.     

微球透镜对亚波长表面结构的显微成像研究

为了研究微球透镜对亚波长物体的成像特性,利用直径为3.4μm的二氧化硅微球透镜对刻录蓝光光碟的亚波长表面结构进行了显微成像实验,观察了不同排列方式和液体浸没深度下微球透镜的成像特性。实验结果表明:微球透镜在不同浸没深度下对亚波长表面结构具有放大作用,放大率为1.2~1.8倍,并且通过微球透镜的密排列,可以获得更大的视场;浸没液体深度增大时,图像的放大率减小,视场增大。基于时域有限差分的电场仿真表明,微球透镜可以将光场汇聚成半高全宽为260nm,纵向可持续几个微米的高强度光区域,引起强的背景散射,从而获得普通光学显微镜不能分辨的亚波长表面结构图像。     

Investigation and Development of Quantum Dot-Encoded Microsphere Bioconjugates for DNA Detection by Flow Cytometry

The development of screening assays continues to be an active area of research in molecular diagnostics. Fluorescent microspheres conjugated to biomarkers (nucleic acids, proteins, lipids, carbohydrates) and analyzed on flow cytometer instruments offered a new approach for multiplexed detection platform in a suspension format. Quantum dots encoded into synthetic microspheres have the potentials to improve current screening bioassays and specifically suspension array technology. In this paper, commercialized quantum dot-encoded microsphere were evaluated and optimized as fluorescent probes to address some of the limitations of suspension array technologies. A comprehensive study was undertaken to adapt the bioconjugation procedure to the quantum dot-encoded microsphere structural and optical properties. Both the leaching-out of quantum dots and microspheres degradation under bioconjugation experimental conditions were minimized. A rapid, efficient and reproducible conjugation method was developed for the detection of single-stranded DNA with the commercialized quantum dot-encoded microsphere. Approximately ten thousand microspheres were conjugated to short amino-modified DNA sequences in one hour with high efficiency. The bioconjugated microspheres acting as fluorescent probes successfully detected a DNA target in suspension with high specificity. Quantum dot-encoded microsphere commercial products are limited which strongly prevents reproducible and comparative studies between laboratories. The method developed here contributes to the understanding of quantum dot-encoded microsphere reactivity, and to the optimization of adapted experimental procedure. This step is essential in the development of this new fluorescent probe technology for multiplex genotyping assay and molecular diagnostic applications.     

非探针近场光学显微镜的成像实现

介绍一种非探针近场光学显微镜，并对它的图像实现过程及处理方法进行了讨论。该装置以阿达玛变换成像理论为基础，用纳米多孔编码板代替光纤探针获得了较高的光学信噪比。成像研究表明，该装置可对近场衰逝波分量进行有效探测并能实现超衍射极限成像，为近场光学探测研究提供了一种新的思路。     

Comment on ‘Super‐resolution microscopy by movable thin‐films with embedded microspheres: Resolution analysis’ [Ann. Phys. (Berlin) 527, 513 (2015)]

This work addresses the shortcomings of the recent paper by Allen et al. [Ann. Phys. (Berlin) 527, 513 (2015)], in which the authors attempted to quantify the spatial resolution and magnification in imaging by using microsphere‐embedded films. Their methodology in resolution and magnification analyses is ill‐considered and worth discussing. Neglecting the impact of the confocal arrangement, used for imaging in their work, on the resolution improvement factor has led to an exaggerated claim of ～λ/6 as the inherent resolution gain of the microsphere. However, this ～λ/6 value cannot be solely attributed to the microspheres because, the effects the pinhole function and image acquisition process of the laser scanning confocal microscope must be separated from their results in order to find the inherent resolution gain of the microsphere. The magnification analysis is flawed for several reasons: invalidity of geometrical optics for micron‐scale spheres, neglecting the impact of the index of the PDMS film surrounding the microsphere, and the cyclic methodology used in presenting the magnification results. Specifically, such large claimed gaps between the object and the microsphere as a mediator of near‐field information contradicts the coupling condition requirement, as claimed by the authors, between the scattered evanescent field of the object and the microsphere.     

表面等离子体平面金属透镜及其应用

由于衍射极限的存在,传统光学透镜成像分辨率理论上只能达到入射光波长的一半。通过恢复和增强携带物体细部特征信息的高频倏逝波,基于表面等离子体的平面金属透镜有望突破这种光学衍射极限,实现超分辨成像。本文对平面薄膜式与纳米结构式两类平面金属透镜进行了综述,详细介绍了若干典型平面金属透镜的结构设计、工作机理及其聚焦性能,并对其特点与存在的问题进行了分析与讨论。由于光波在金属中传播时存在一定损耗,如何更高效地增强高频倏逝波信号并转换成传播波,使其参与成像,以更好地实现远场超分辨成像,以及如何进一步增大近场超高分辨率聚焦光斑焦深以及减小远场聚焦光斑尺寸,是表面等离子体平面金属透镜进一步研究的重点。     

Quantum Dots Luminescence Collection Enhancement and Nanoscopy by Dielectric Microspheres

In recent years, dielectric microspheres have been used in conjunction with optical microscopes to beat the diffraction limit and to obtain superresolution imaging. The use of microspheres on quantum dots (QDs) is investigated, for the first time, to enhance the light coupling efficiency. The enhancement of the QD luminescence collection in terms of extraction and directionality is demonstrated, as well as the enhancement of spatial resolution. In particular, it is found that a dielectric microsphere, placed on top of an epitaxial QD, increases the collected radiant energy by about a factor of 42, when a low numerical aperture objective is used. Moreover, if two or more QDs are present below the microsphere, the modification of the far field emission pattern allows selective collection of the luminescence from a single QD by simply changing the collection angle. Dielectric microspheres present a simple and efficient tool to improve the QD spectroscopy, and potentially QD-based devices.     

微球透镜亚波长显微成像远场特性实验研究

利用低折射率的二氧化硅和高折射率的钛酸钡微球透镜对蓝光刻录光碟的亚波长表面结构进行了显微成像实验,观察了两类微球在空间上与样品表面分离时的成像特性.实验结果表明:在微球透镜与样品表面分离0～6μm的空间范围内,微球透镜对亚波长纳米结构仍具有分辨能力,且放大作用明显.通过实验比较,发现在浸没方式、放大率大小、成像尺度范围...