抗HBsAg单链Fab抗体基因酵母表达载体的构建

采用重叠PCR技术 ,以抗乙肝表面抗原 (HBsAg)IgG铰链区基因为Linker将Fab抗体基因的重链和轻链连接起来 ,构成单链Fab基因。通过测序鉴定 ,克隆的单链Fab基因与理论上的完全一致 ,并成功构建含完整单链Fab基因的毕赤酵母 (P pastoris)表达载体。     

法夫酵母类胡萝卜素的分析测定研究

对法夫酵母类胡萝卜素的光谱学特征、分光法测定法夫酵母类胡萝卜素总量、高效液相色谱测定法夫酵母虾青素进行了研究．在二甲基亚砜丙酮混合液中,法夫酵母类胡萝卜素最大吸收峰的波长范围为473～481nm;以虾青素为标准样,用分光法测定法夫酵母类胡萝卜素总量和用高效液相色谱法测定法夫酵母虾青素标准曲线回归模型的R2值超过了0．999,样品的回收率分别在98．85％～102．60％和99．96％～102．44％之间,RSD值分别在0．30％～7．00％和0．61％～2．26％之间,都在定量分析的阈值范围内,能满足定量分析的要求．用建立的方法对分批培养的法夫酵母样品进行分析,结果表明,法夫酵母主要在对数生长期和稳定期合成类胡萝卜素．     

法夫酵母人工诱变及突变株筛选的研究

用硫酸二乙酯对法夫酵母进行了诱变,并用薄层色谱法及高效液相色谱法对突变株进行了筛选鉴定,当诱变剂浓度为1％、诱变温度为20℃时,法夫酵母诱变处理的最适时间约为5min．根据视觉差异分离二苯胺平板上长出的法夫酵母菌落,用薄层色谱法初筛,并用液相色谱法鉴定出了虾青素高产菌株、虾青索低产菌株、类胡萝卜素组成缺陷菌株．     

甲醇酵母表达系统pMIRH型载体研究

在为甲醇酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）表达系统成功构建高拷贝整合型表达载体ｐＭＩＲＨ－１的基础上,构建了更能满足外源基因表达需要的、大小仅为７３００ｂｐ的高拷贝整合型表达载体ｐＭＩＲＨ－２．有关转化、筛选及传代稳定性试验结果表明,ｐＭＩＲＨ－２亦具有与ｐＭＩＲＨ－１相似的转化和筛选特性及高拷贝整合能力,且二者均可在非选择条件下稳定传代６０代以上．     

天蚕抗菌肽B基因在毕赤酵母中多拷贝表达载体的构建

根据Bgl Ⅱ和BamHⅠ同尾酶的特点,通过对pPIC9K／CB进行改造,获得了不含BamHⅠ位点的CecropinB表达框,并在此基础上构建了含三拷贝CecropinB表达框的毕赤酵母表达载体,为CecropinB的进一步开发与应用打下了基础。     

维生素对红法夫酵母产虾青素的影响

采用单因素实验方法研究了不同维生素对红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)生长及虾青素积累的影响.结果表明:生物素、泛酸钙、肌醇、VB1可显著提高红法夫酵母的生物量、类胡萝卜素和虾青素的产量,其较适质量浓度分别为0.05,25.00,0.50,0.05 mg/L.VB12和核黄素对红法夫酵母的细胞生长有明显的促进作用,同时可略微提高虾青素产量,其较适质量浓度分别为0.50和0.005 mg/L;VB6、烟酸和叶酸虽然可促进细胞生长,但却明显抑制了虾青素的积累;而硫辛酸既抑制细胞生长也抑制其虾青素的积累.根据单因素实验结果,在培养基中按以上较适浓度添加生物素、泛酸钙、肌醇、VB1、VB12和核黄素,菌体生物量和虾青素质量浓度分别达到5.000 g/L和16.77 mg/L,较对照组分别提高了33.2%和108%.     

利用葡萄糖母液流加发酵提高夫法酵母产量的研究

以葡萄糖母液为基质对夫法酵母进行了间歇，恒速及变速流加发酵实验，建立了简单，数学模模型流加。实验结果表明，以葡萄糖母液为基质培养夫法酵母生产胡萝卜素是可行的。同时，变速流加可显著提高夫法酵母的产量。当流加控制因子Ｋ＝８．７＊１０＾－４时，变速流加发酵比间歇发酵夫法酵母产量提高了５８．４％。     

红法夫酵母高产虾青素菌株的选育

红法夫酵母可以通过发酵糖类产生虾青素,虾青素是一种极具潜力的色素和抗氧化剂,在水产养殖、饲料、食品和医药工业中具有广阔的应用前景。通过紫外诱变的方法,对红法夫酵母进行高产茵株的选育,最终筛选到3株理想菌株Puv-7、Puv16和Puv-24,其产量相对原始菌株分别提高了34．7％、353％和46％。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP，MP基因的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段，经过Sal I和Rst I酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒相互作用的寄主因子、克隆寄主因子，推测其种类和功能打下基础。     

ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建

利用PCR技术,以酿酒酵母S288c的基因组DNA为模板,扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合成酶基因(ScINO1)包含1 602bp的开放读码框,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定,测序结果与GenBank上已登录的ScINO1序列完全一致.对PUG6载体进行改造,构建了rDNA介导的多拷贝整合表达载体pURH,并将ScINO1基因连入载体pURH,获得ScINO1基因超表达载体pURIH.为下一步的微生物发酵法产肌醇和获得能够耐高乙醇的酵母工程菌株的研究奠定基础.     

红发夫酵母原生质体形成的影响因素

研究了制备红发夫酵母原生质体的影响因素．菌体的培养时间、培养温度、酵母代数、培养基装液量、酶含量、高渗溶质性质、pH值、酶解温度和酶解时间等都对原生质体的形成产生较大的影响．原生质体形成的最适条件是：0～2代酵母在15或25℃培养12～16h，装液量100mL，用0．8mol/L KCl作高渗稳定剂，酶含量l％，酶解温度22℃，酶解时间16h，酶解pH8.0。     

不同碳源及其浓度对红发夫酵母培养的影响

研究了不同碳源及浓度对红发夫酵母Phaffia rhodozyma生长及虾青春积累的影响。 结果表明碳源浓度在20－30g/L范围内对红发夫酵母生长及虾青素合成有利。在所研究的领域中，糖蜜有利于生长，而木糖有利于虾青春积累。采用木糖和糖蜜的混合碳源，虾青春产量达到1．9mg/L。     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

米根霉、法夫酵母双菌共发酵淀粉生产虾青素的初步研究

对米根霉、法夫酵母共发酵淀粉生产虾青素进行了研究．摇瓶试验结果表明，米根霉、法夫酵母共发酵淀粉生产虾青素适宜的培养基为淀粉50g／L、1gKH2PO4/L、1g CaCl2／L、1g酵母膏/L、0.5gMgSO4／L、5g（NH4）2SO4/L，控制培养基初始pH为8．0、发酵温度为22℃及同时接种米根霉和法夫酵母有利于虾青素的合成，5L罐试验结果表明虾青素合成滞后于糖的利用，且分成两个增长阶段，虾青素的最大产量达2．48mg／L．这些试验结果不仅证实了共培养米根霉和法夫酵母发酵淀粉生产虾青素的理论可行性，而且为进一步利用淀粉为原料生产虾青素提供了试验参考．     

生物素对红发夫酵母生长和虾青素积累的影响

在摇瓶中研究生物素对红发夫酵母生长和虾青素积累的影响.结果表明生物素的添加能促进细胞生长,但对细胞内虾青素含量的提高不利.添加10μg/L生物素时,最大比生长速率达到0.110 h-1;添加6μg/L生物素时,达到最大细胞干重9.95g/L,比没有添加生物素时的7.53g/L提高32%.添加2μg/L生物素时,达到最高虾青素产量和产率,分别为3 825 μg/L和53μg/(L@h),比没有添加生物素时的2 944 μg/L和41μg/(L@h)提高30%.没有添加生物素时,达到最高细胞虾青素含量391μg/g.利用添加2μg/L生物素的方法可以提高虾青素产量,这种方法为提高虾青素产量提供了一种简单廉价的方法.     

重组表达载体pGEM-VLA4的构建

从人外周血细胞中提取mRNA,用RT-PCR法扩增含BamH与HindⅢ酶切位点VLA4基因序列,运用分子生物学方法将该序列克隆到pGEM中,构建成VLA4基因序列的真核表达载体并进行鉴定分析.对重组载体用双酶切系统酶切后进行电泳并测序,结果证明目的基因克隆及连接方向正确,测序结果正确.通过实验,成功地构建了含VLA4基因的真核表达载体pGEM-VLA4.     

菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体构建及原核表达

分析菠菜叶绿体基因组全序列,选用了rbcL基因和accD基因的间隔区作为外源基因的定点整合位点,并从菠菜叶绿体基因组中克隆了rbcL基因全长和accD基因的5′端部分,长度分别为1956 bp和1320 bp。以这2个DNA片段作为同源重组片段,以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3′控制外源基因的转录,构建了包含筛选标记基因aadA基因(编码氨基糖苷-3′-腺苷酸转移酶,具有壮观霉素和链霉素抗性)和报告基因GFP(编码绿色荧光蛋白)的菠菜叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGA。酶切结果显示构建正确。将该载体转化大肠杆菌,在激光扫描共聚焦显微镜下用488 nm蓝光激发,发现大肠杆菌发出强烈的绿色荧光,而对照菌体没有荧光,表明GFP基因在原核大肠杆菌中已经成功表达。实验结果说明构建的菠菜叶绿体定点整合表达载体pRAGA可以用于菠菜叶绿体转化。     

链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.