谷胱甘肽过氧化物酶模拟物2-位碲桥联环糊精的合成及催化作用

 以β－环糊精（CD）为酶模型，将Te引入β－环糊精中，成功地合成出一种新的水溶性好、活力高的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）小分子模拟物2－TeCD，并对其结构进行了表征．采用Wilson辅酶偶联法，间接测定了2－TeCD催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原H2O2的GPX活力为46．7U／μmol，与文献报道的数据相比，2－TeCD的GPX活力最高．通过考察2－TeCD催化GSH还原H2O2反应的动力学，发现反应初速度对底物浓度的双倒数曲线为一组平行线，表明2－TeCD所遵循的催化机制可能为三转移乒乓机制．通过考察自由基捕获剂2，4－二叔丁基甲基苯酚对酶促和自发反应速率的影响，发现2－TeCD催化的酶促反应为非自由基机理．通过考察酶不可逆抑制剂碘乙酸对酶促反应速率的影响，发现2－TeCD催化反应过程中不生成碲醇中间体．由此推测出2－TeCD的催化循环经历碲硫化合物、次碲酸硫酯和次碲酸中间体．该催化循环与含硒GPX小分子模拟物所经历的催化循环不同，以及环糊精对底物具有识别与结合的能力，可能是2－TeCD具有高GPX活力的主要原因．     

谷胱甘肽过氧化物酶模拟物碲化透明质酸的合成及催化动力学研究

 以透明质酸(HA)作为谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的酶模型,将碲(Te)引入HA中,合成了一种新型的高活力的GPX模拟物碲化透明质酸(TeHA). 用红外光谱和核磁共振技术对TeHA的结构进行了研究,证明Te的修饰位点位于HA的N-乙酰氨基葡萄糖的羟甲基(-CH2OH)上. 采用Wilson辅酶偶联法测定得到TeHA催化还原型谷胱甘肽(GSH)还原H2O2的GPX活力为163.6 U/μmol, 高于文献报道的其它模拟酶. TeHA还能够催化GSH还原异丙苯基过氧化物(CuOOH)和叔丁基过氧化物(t-BuOOH)的反应,并且CuOOH为该模拟酶的最适底物. 通过研究TeHA催化GSH还原三种不同过氧化物的反应动力学发现, TeHA的催化遵循乒乓机制.     

基于γ-环糊精的谷胱甘肽过氧化物酶模拟物的构建及催化作用

基于对天然谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)结构与功能的理解,我们利用超分子化学的方法和原理,选择γ-环糊精为骨架,通过引入催化基团硒或碲,设计并合成了7种基于γ-环糊精的新型谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)模拟物,并采用元素分析、红外光谱、核磁共振等手段对其结构进行了详细的表征和确认。运用GPX经典双酶体系法测定了它们的GPX活性,实验结果表明:6,6’双碲桥联γ-环糊精(6-diTe-γ-CD)表现出了最高的GPX活性,其催化GSH还原过氧化氢(H2O2)、叔丁基过氧化氢(t-BuOOH)和枯烯过氧化氢(CuOOH)的活力分别是传统小分子硒酶Ebselen的147.3、1897.9和663.9倍,该结果是目前报道的环糊精GPX模拟物中酶活力最高的。     

2-位碲桥联环糊精的制备、表征及其谷胱甘肽过氧化物酶活性的研究

该文以三种母体环糊精(CD),即α-、β-和γ-CD为修饰模板,将功能性基团有机碲引入到环糊精次面的2位羟基上,制备得到了三种具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的GPX模拟物。采用元素分析、红外光谱、核磁共振等手段对三种环糊精衍生物的结构进行了表征。运用GPX经典双酶体系法测定了三种环糊精衍生物的GPX活性,实验结果表明三者均具有很高的催化活性,其中2-位碲桥联γ-环糊精(2-Te-γ-CD)具有最高的GPX活性,其催化谷胱甘肽(GSH)还原过氧化氢(H2O2),叔丁基过氧化氢(t-BuOOH)和枯烯过氧化氢(CuOOH)的活力分别是传统"小分子硒酶"Ebselen的80.5,333.3和118.3倍。     

表面等离子体子共振传感器研究谷胱甘肽过氧化物酶模拟物与底物的结合作用

采用表面等离子体子共振(SPR)传感装置,固定入射角,以波长为变量,以CCD为检测系统,用对金有较强吸附作用的谷胱甘肽(GSH)为基底膜,研究了GSH分别与谷胱甘肽硫转移酶(GST)与小分子GPX模拟酶2-位-碲桥联-β-环糊精(2-TeCD)的动力学过程,计算得GSH与GST的结合常数为2.82×106L/mol;GSH与2-TeCD的结合常数为3.92×102L/mol。结果表明:本方法可以用来评价小分子GPX模拟酶与底物的结合程度,简便快捷,不需标记样品,可以实时监测反应过程,作用后酶与底物易于分离,分离后的酶可以继续使用等优点。     

以透明质酸为骨架的新型谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)模拟酶的制备及性质研究

用修饰法合成以透明质酸为骨架的两种新型GPX模拟酶: 硒化透明质酸SeHA及碲化透明质酸TeHA. 用红外光谱和核磁共振波谱对模拟酶的结构进行研究, 证明其修饰位点位于透明质酸的N-乙酰氨基葡萄糖的—CH2OH. 用二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)法测定模拟酶的硒含量为1.2%. 通过模拟酶对3种不同底物过氧化氢(H2O2)、过氧化氢正丁烷(t-BuOOH)和过氧化氢异丙苯(CuOOH)的催化活性的研究结果表明CuOOH为该反应的最佳底物. 研究模拟酶催化谷胱甘肽(GSH)还原3种过氧化物的动力学发现, 反应速率与底物浓度的双倒数曲线均为平行的直线, 说明模拟酶反应的动力学机制与天然GPX相同, 为乒乓机制. 用2,4-二叔丁基甲基苯酚(BHT)法证明了该催化反应为非自由基机理, 且模拟酶不易被碘乙酸抑制.     

具有谷胱甘肽过氧化物酶活力的含碲环糊精衍生物

设计并合成了谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)模拟物6A,6A’-二苯胺-6B,6B’-二碲桥联-β-环糊精(6-AnTeCD),采用双酶偶联法进行GPx活力测定和酶反应动力学分析,通过噻唑蓝(MTT)比色法评价了6-AnTeCD对H2O2诱导心肌细胞氧化损伤的保护作用.结果表明,6-AnTeCD催化谷胱甘肽(GSH)还原过氧化氢(H2O2)的活力高于6-AnSeCD、6,6’-二碲桥联-β-环糊精(6-TeCD)和Ebselen等GPx模拟物.稳态动力学分析显示,6-AnTeCD的催化机制为乒乓机制.6-AnTeCD分子兼具引入底物结合部位和改造催化部位的双重优点,具有分子量小、毒性低及可有效保护心肌细胞免受氧化损伤的优点.     

GSH对两种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物活性影响的研究

设计并合成了谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)模拟物6A,6A’-二苯胺-6B,6B’-二硒桥联-β-环糊精(6-AnSeCD). 采用双酶偶联法测定GPX的活力结果显示, 6A,6A’-二环己胺-6B,6B’-二硒桥联-β-环糊精(6-CySeCD)催化谷胱甘肽还原H2O2和枯烯H2O2的活力均比6-AnSeCD的高. 为了进一步考察6-CySeCD和6-AnSeCD与GSH之间的相互作用, 进行了分子动力学(MD)模拟和分子对接研究. 结果表明, 与GSH的结合使GPX模拟物的构象发生变化, 这种改变可能是影响桥连GPX模拟物催化活性的关键因素.     

通过快速定点突变表征人源含硒单链抗体酶的底物结合部位

为了对人源含硒单链抗体酶Se-scFv-B3的底物结合部位和催化基团进行研究, 在理论预测的基础上, 通过快速定点突变法分别在2个理论预测的底物结合部位(位点1和位点2)内选定Ala180和Ala44定点突变为丝氨酸(Ser). 2个突变体蛋白经化学修饰将Ser转变成谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化基团硒代半胱氨酸(Sec)后, 前者的GPX活力达到了Se-scFv-B3的2倍多, 而后者的GPX活力没有明显提高, 这表明位点1可能是主要的底物结合部位, 与理论预测的结果一致.     

氧化型谷胱甘肽对还原型谷胱甘肽清除自由基的协同作用

利用分光光度法和基质辅助飞行质谱法研究了谷胱甘肽对1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基的清除作用.通过比较不同浓度和不同配比的还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及Na2SeO3混合溶液的自由基清除率,发现GSH/GSSG的配比对自由基清除率有明显影响.当GSH/GSSG的配比大于50∶ 1时,自由基清除率比同浓度的GSH大,且自由基清除率随GSH和GSSG的绝对浓度的增加而明显增加,说明适量的GSSG可协同催化GSH清除自由基过程.质谱测定结果表明: 此协同作用与GSSG 参与自由基清除过程中的自由基反应有关.Na2SeO3对GSH的清除自由基的影响主要是通过与GSH反应生成GSSG来调控GSH/GSSG配比的结果.通过测定和分析一定配比的GSH+GSSG混合溶液与DPPH作用前后的质谱图,提出了少量的GSSG共存下,GSH催化清除DPPH自由基的作用机理.     

疏水腔修饰法及高活力GPX抗体酶的研究：Ⅱ.半抗原及全抗原的制备和表征

自Jencks抗体酶的概念出现以来，已有80多种化学反应被证实可以用抗体来催化［‘”j．一般合成抗体酶的方法是通过选择合适的过渡态类似物来诱导抗体酶，这种方法产生的抗体酶大部分活力很低，我们曾对3个具有谷脱甘肽（GSH）过氧化物酶（GPX）特性的含硒抗体酶进行了报道「”‘a，半抗原是，2，3是根据天然抗体酶活性中心的结构设计合成的，它们对GPX的底物GSH具有不同程度的疏水修饰．随着半抗原疏水程度的增加，通过单抗技术和化学修饰而得的3个抗体酶的相应活力分别为兔肝GPX的0．2，1·6和8．5倍．在上述结果基础上，我们提出疏…     

电位法测定谷胱甘肽转移酶活性的研究

谷胱甘肽转移酶(GSTs)是生物体内一种重要的解毒酶,催化异源物与谷胱甘肽结合,有多种方法测定其活性,但都基于大分子产物。本实验基于H.Habig方法,探讨用氯离子选择电极,根据反应体系中Cl-浓度的变化来测定谷胱甘肽转移酶的活性。研究结果表明,利用透析膜包裹电极可以消除底物谷胱甘肽(GSH)对电极的干扰,生物反应体系中可能存在的离子、小分子(如Br-I、-、H2O2和Vc)对电极没有影响。此方法重现性良好,相对标准偏差为3.54%。     

漆树漆酶的催化氧化作用 (ⅹⅢ)──Fe~(2+)离子对漆酶催化氧化反应的影响()

以５,６－二溴－２,３－二氰基氢醌为底物,在ｐＨ４．５０条件下,用分光光度法考察了ＦｅＳＯ４对漆树漆酶催化氧化反应的影响．结果表明,在本文实验条件下ＳＯ２－４离子对酶促反应的影响基本可以忽略,而Ｆｅ２＋离子对漆酶的催化氧化反应则有明显的竞争性抑制作用．研究证实,Ｆｅ２＋离子的抑制作用是通过它还原酶促反应的产物半醌自由基阴离子来实现的     

羰基还原酶CR2重组酶体系不对称合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺

构建了羰基还原酶CR2重组酶体系,并优化了相关的酶促催化反应条件.通过在催化体系中添加辅酶NADP+(0.1 mmol/L)和辅底物葡萄糖(120 g/L),在30℃及p H=8.0的条件下反应4 h,CR2重组酶体系不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP,10 g/L),合成了高光学纯度(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺[(S)-DHTP,e.e.值99.9%],产率为62%.在酶促催化过程中,由于辅酶循环生成葡萄糖酸导致反应体系p H值下降而影响催化效率.通过调控反应体系p H值,(S)-DHTP的产率提高到68%.不同浓度底物的反应过程表明底物对CR2酶促反应具有抑制作用,且在10 g/L底物浓度下反应的时空产率可达1.3 g·L-1·h-1.     

血红蛋白的过氧化物酶催化特性研究

探讨了用血红蛋白（Hb)作为辣根过氧化物酶（HRP）的替代物，用于率H2O2氧 化对甲基酚的反应体系，研究了血红蛋白的过氧化物酶特征及其酶催化动力学特性 。稳态速率法测定了米氏常数（Km)、米氏速率（Vm)及反应级数等动力学参数。讨 论了对甲基酚作为血红蛋白的氢供体底物的酶催化反应机理，确立了反应速率方程 。实验比较发现血红蛋白作为过氧化物酶（HRP）的替代物，其催化活性比氯化血 红素（Hemin)，β-环糊精－氯化血红素（β－CD－Hemin)等过氧化物模拟酶要高。     

H2O2-四丁基溴化铵-醋酸盐体系中肉桂酸的吸附平行催化波研究

在醋酸盐（ＰＨ＝４．０）－四丁基溴化铵（Ｂｕ_４Ｎ·Ｂｒ）－Ｈ_２Ｏ_２缓冲溶液中，用线性扫描示波极谱法、循环伏安法和数字模拟法等方法研究了肉桂酸（Ｃ_６Ｈ_５－ＣＨ＝ＣＨ—ＣＯＯＨ）的 吸附平行催化波产生机理．结果表明，肉桂酸的还原机理为 ＥＣ_ｄｉｍＥ’过程，即内桂酸的Ｃ＝Ｃ双键首先发生ｌｅ，１Ｈ~＋还原（Ｅ）产生一个中间体自由基Ｃ_６Ｈ_５－Ｃ·Ｈ－ＣＨ_２－ＣＯＯＨ，随后该自由基在以ｌｅ，１Ｈ~＋方式进一步还原（Ｅ’）的同时伴随着该自由基间的二聚化反应（Ｃ_ｄｉｍ）．由于Ｂｕ_４Ｎ~＋质点的诱导吸附作用，肉桂酸的极谱电流增加，峰电位正移．Ｈ_２Ｏ_２氧化肉桂酸还原中间体自由基使原Ｃ＝Ｃ双键再生（Ｃ’），同时阻止了该自由基的进一步还原和二聚化反应，产生了平行催化波．该催化波的产生机理为ＥＣ＇过程．Ｈ_２Ｏ_２氧化肉桂酸自由基的表观速率常数Ｋ_ｆ为 １．３５ ×１０~２ｍｏｌ· Ｌ~(－１)· ｓ(－１)．提出了一种有机化合物极谱催 化波的新类型──由表面活性剂和氧化剂双增敏的吸附平行催化波．     

漆树漆酶的催化氧化作用（ⅫⅡ）

以５,６－二溴－２,３－二氰基氢醌为底物,在ＰＨ４．５０条件下,用分光光度法考察了ＦｅＳＯ４对漆树漆酶催化氧化反应的影响。结表明,在本文实验条件下ＳＯ４＾２－离子对酶促反应的影响基本可以忽略,而Ｆｅ＾２离子对漆酶的催化氧化反应则有明显的竞争性抑制作用,研究证实,Ｆｅ＾２＋离子的抑制作用是通过它还原酶促反应的产物半醌自由基阴离子来实现的。     

环糊精衍生物在金属催化有机合成中的应用

综述了环糊精(包括α-环糊精,β-环糊精和γ-环糊精)衍生物在金属催化有机合成中的应用,主要包括其作为金属离子配体、金属纳米粒子稳定剂和反相相转移催化剂在氧化、水解、还原、偶联等金属催化反应中的应用.其中环糊精衍生物作为金属离子配体应用最广,由于环糊精部分与底物形成包结络合物,拉近了底物和具有催化活性的金属离子的距离,并固定了底物的反应部位,往往可以显著提高催化反应的反应速率,增强反应的区域选择性和对映选择性.     

具有GPX活力的抗体片段Fv的制备和性质

具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的鼠抗体3H₄(IgM)经胃蛋白酶水解,产生分子量为25000的抗体Fv片段,用荧光滴定法测定了它与GSH的亲和常数K_a=1.17×10₇L/mol.该片段经苯甲基磺酰氟活化,再经NaHSe作用,其结合部位的丝氨酸被突变为谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化基团硒代半胱氨酸.突变后的Fv片段表现出很高的GPX活性,其活力高达2500U/μmol,称为Fv抗体酶.动力学分析表明,Fv酶的最适温度为55℃,最适pH为7.0,催化机制为乒乓机制,米氏常数分别为:K_m(GSH)=4.16×10^-3mol/L,K_m(H₂O₂)=2.8×10^-4mol/L.     

谷胱甘肽过氧化物酶模拟物的合成及其催化机理研究

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px。ECl。11。1。9)是一种含硒蛋白质,由4个相同的亚基构成,它以还原型谷胱甘肽为底物,催化还原H_2O_2和ROOH。 GSH-Px催化还原氢过氧化物的机理为乒乓机理,催化过程包括两个循环,其中B循环慢于A循环。Reich和Jasperse提出的关于有机硒模拟物的催化机理与天然酶的催化反应不同,反应过程中有氮原子的参与,本文合成的有机硒化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ为季铵盐型,氮原子无法参与催化反应过程中的成键及断键。因此,必须寻求新的反应机理。