多维液相色谱-质谱用于酶解猪血蛋白中活性肽的研究

以强阳离子交换柱（SCX）为一维色谱柱,反相柱（RP）为二维色谱柱,采用在线捕集接口形式,通过10通阀连接一、二维色谱柱,构建了二维液相色谱分离系统。将该系统用于酶解猪血蛋白中对血管紧缩素Ⅰ转移酶（ACE）具有活性抑制作用的肽进行分离、鉴定,共检测出104个组分。收集一维馏分,离线注入LC—MS,鉴定出其中含有SAL、DKF、ESF、STVL及FESF5个小肽。     

酶解鹿茸肽的制备、纯化及抗氧化活性

利用一种工业用碱性蛋白酶对新鲜梅花鹿鹿茸进行水解制备生物活性肽。首先,考察了酶用量、底物浓度和反应时间对水解反应的影响,确定了最佳水解条件为酶浓度1：150,底物浓度1：13,水解时间60 min。其次,利用硫酸胺分级沉淀法制备了鹿茸多肽粗提液,同时采用缓冲液保护其活性,再经Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离纯化,得到了具有最强抗氧化活性的鹿茸肽组分（VAP-B）。最后,利用制备型高效液相色谱柱对VAP-B进一步纯化,得到了分子量在800以内的小肽活性组分（VAP-B1）,其蛋白含量为70.45%。在此基础上,对小肽活性组分VAP-B1进行了理化性质分析,检测其抗氧化活性,包括清除超氧阴离子,羟自由基以及抗脂质过氧化的能力和还原能力。实验结果表明,鹿茸肽VAP-B1浓度为20mg/ml时,对邻苯三酚自氧化的抑制率达到91.9%,有明显的清除超氧阴离子的作用;浓度为10mg/ml时,对羟基自由基的清除作用达到100%,且在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系。此外,鹿茸肽VAP-B1具有一定的防止脂质过氧化和还原力作用。     

兔胚泡小分子肽的生物功能研究

本文用~3H胸腺嘧啶掺入法研究了兔胚泡液中妊娠特异的小分子肽(RBPs)抑制淋巴细胞转化的作用。实验结果指明RBPs具有抑制植物血球凝素(PHA)刺激大鼠淋巴细胞转化的作用,对人血液淋巴细胞的转化亦有抑制作用,在一定的RBPs浓度范围内(40—200μg/2.5ml)其抑制作用与其浓度相关,浓度增加其抑制程度也大。人绒毛膜促性腺激素、孕酮和孕兔血清均无显著抑制作用。实验又指明RBPs(200μg/ml)对子宫组织PGF_(2α)的分泌也有显著抑制作用;但对子宫内膜~3H亮氨酸的掺入却有增进效应,此效应能被放线菌素酮所抑制。     

pH值敏感相分离特性的蛋白质酶解试剂研究

通过DEC/NHS偶联反应将胰蛋白酶(Trypsin)连接到具有pH值敏感性的壳聚糖(CS)链上.Trypsin-CS偶联物保留了CS的pH值敏感相分离特性及Trypsjn的酶催化活性.浊度滴定实验表明,此偶联物的临界相分离pH值(CPSP)仍保持在偏中性范围内,并且随CS的分子量降低而略有上升.这种偏中性的CPSP值...     

促δ-波睡眠肽的结构与功能的研究

用固相法合成了促δ-波睡眠肽Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Glu(DSIP)及其十四种类似物和三个短肽,研究了结构与功能的关系,类似物的设计,主要考虑在分子中引入D-氨基酸以抑制酶的作用和增强稳定性,以及引入疏水侧链氨基酸如Phe和Trp等。位置的修饰主要在1,3,4,5,8和9位,即:D-Trp[1],Tyr[1],Tyr[1]Phe[5],D-Trp[1]Phe[8],Trp[3,4],D-Trp[3,4],D-Trp[1,3,4]Phe[8],D-Glu[9],D-pF-Phe[3,4]Phe[8]D-Glu[9],Phe[5],Glu[5]Asp[9],Tyr[5]Asp[9],Ala[7]和Asp[9]-DSIP以及Trp-Ala-Gly-Gly-Asp,Trp-Ala-Gly-Gly-Glu和Trp-Gly-Glu.合成肽的纯度经氨基酸组成分析、元素分析、薄层层析以及纸电泳鉴定。生物试验表明D-Trp[1],Tyr[1],Tyr[1]Phe[5],Ala[7]-DSIP无促眠活性;而Phe[5]-DSIP的促眠活性与DSIP相接近,其他类似物的生物试验结果将另文发表。     

海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的分离纯化及合成

采用Sephadex G-25凝胶柱层析、SP Sephadex C-25 阳离子交换层析和反相高效液相色谱等方法对海地瓜水解产物进行分离纯化, 得到了一种新的强活性ACE抑制肽, 其氨基酸序列为MEGAQEAQGD, IC₅₀值为15.9 μmol/L. 采用逐步缩合和片段缩合的方法对该抑制肽进行了设计合成. 合成肽的纯度为99.72%, 分子量与序列结构均与理论值相符. 研究发现, 抑制肽与胃蛋白酶和糜蛋白酶水解反应后, 活性增强了3.5倍. 动物实验结果表明, 剂量为3 μmol/kg的抑制肽对大鼠自发性高血压具有明显的降压效果.     

超高效液相色谱-串联质谱法测定牛源性酪蛋白方法中酶解条件的优化及酶解性能的评价

为提高质谱法测定蛋白质的准确性,对酶解条件的优化和选择并建立最佳条件,以期提高回收率。设计了7种酶解方法进行了比较,并引入豆浆作为阴性基质。其中直接酶解法被选为最佳方法,其操作操作过程如下:取1g豆浆粉溶于10mL的50mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中制成豆浆提取液,取200nmol·L-1β-酪蛋白溶液200μL,加入豆浆提取液300μL,再加10μg质谱级胰蛋白酶,混匀后于37℃恒温酶解16h,加入10%(体积分数)甲酸溶液10μL,终止反应,加水定容至1.0mL,高速离心10min,取上清液进样,按仪器工作条件测定VLPVPQK特征肽段的峰面积。此方法的平均酶解效率为106%,相对标准偏差(n=5)为5.1%。方法中选择酶的加入量w酶与β-酪蛋白量wβ-酪蛋白量之比为1∶20。在方法的优化过程中不建议进行还原和烷基化步骤。     

类蛋白反应修饰海地瓜酶解物及ACE抑制肽的制备

采用类蛋白反应修饰海地瓜体壁蛋白酶解物,制得修饰肽的血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性与原酶解液的活性相比显著提高;模拟消化实验结果表明,修饰肽与胃肠蛋白酶作用后可增强其降压活性;细胞毒性实验结果表明,样品浓度在低于10 mg/mL时对犬肾细胞(MDCK)无毒性,且低浓度可以促进细胞生长.采用超滤、Sephadex G-15凝胶柱层析和RP-HPLC等分离技术纯化修饰产物,得到高活性ACE抑制肽(IC50值为3.67μmol/L),序列结构为NQNFVQYTTNT.紫外光谱分析结果表明,修饰肽与ACE结合可引起吸光度变化.用SYBYL软件对抑制肽与ACE活性位点进行模拟对接,发现该抑制肽能与ACE很好地结合.     

肽脱甲酰化酶抑制剂的合成及其抑菌活性

通过对肽脱甲酰化酶抑制剂构效关系的研究,以放线酰胺素为先导化合物,设计并合成了一系列异噁唑类化合物。其结构经1H NMR,IR,MS和元素分析表征。生物活性实验表明,该类化合物对标准肺炎克雷白球菌有显著的抑菌活性。     

中国毛虾流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的研究

以中国毛虾为原料, 以抑制流感病毒神经氨酸酶(NA)活性为初筛指标, 通过控制酶切位点制备了具有抑制NA活性的酶解液. 利用凝胶层析和高效液相色谱等技术分离纯化出高活性的抑制肽, 其IC₅₀ 值为96.1 μmol/L.经串联质谱测定该抑制肽序列为EISYIHAEAYRRGELK, 紫外光谱分析结果证明该抑制肽能与NA结合.基于反向对接, 应用SYBYL软件模拟抑制肽与NA活性区域结合, 确定了抑制肽与NA的结合位点. 细胞毒性实验测得该抑制肽对细胞的最大无毒浓度(TC₀)为1.26 mg/mL.在红细胞凝集实验中, 随着抑制肽浓度增大, 病毒的凝集价显著降低, 证明抑制肽的抗病毒作用具有多靶点.     

2709碱性蛋白酶水解BSA蛋白肽谱变化的研究

以2709碱性蛋白酶酶解牛血清白蛋白为研究对象,采用液相色谱-飞行时间质谱联用分析方法和位点非特异性酶切肽谱鉴定方法,分析水解过程中肽谱的动态变化。蛋白电泳分析结果显示,2709碱性蛋白酶在0.1%的添加比例条件下,0.5 h内可将全部蛋白降解,表明其具有极强的水解能力。肽谱分析结果显示,该酶酶解BSA蛋白过程中肽谱变化复杂多样,不同序列多肽具有不同的动态变化特征。酶切位点分析结果显示,2709碱性蛋白酶几乎能在所有种类的氨基酸位点发生酶切,但酶切的频率并不相同,这表明该酶在水解位点上具有宽泛的选择性和一定的倾向性,其中在肽键C端氨基酸种类的选择上具有明显的亮氨酸倾向性。该文可为研究其他工业蛋白酶水解肽谱的规律提供借鉴,并有助于提高我国工业蛋白酶制剂的应用水平和蛋白质加工水平。     

活血化瘀方药与微量元素对高脂血症的治疗分析

重点讨论了活血化瘀方药所含的微量元素对高脂血症的治疗作用。     

Solution Structure and Model Membrane Interactions of P‐113, a Clinically Active Antimicrobial Peptide Derived from Human Saliva

P‐113, AKRHHGYKRKFH‐NH₂, was derived from human saliva and found to possess clinical activity against fungus infections in HIV patients with oral candidiasis. We have determined the solution structure of P‐113 bound to membrane‐mimetic SDS micelles by two‐dimensional NMR methods. The SDS micelle‐bound structure of P‐113 adopts an α‐helical segment and the positively charged residues are clustered together to form a hydrophilic patch. A variety of biophysical and biochemical experiments, including circular dichroism, fluorescence spectroscopy and microcalorimetry, were used to show that P‐113 interacted with negatively charged phospholipid vesicles and induced dye release from these vesicles. However, its dye leakage efficiency is much less than the results of previously reported antimicrobial peptides. These results suggest that the antimicrobial activity of P‐113, unlike other antimicrobial peptides, may act not only through binding to and destabilization of the microbial membrane but also through a specific protein receptor on the microbial cell surface.     

Isolation and Identification of Anti-Inflammatory Peptide from Goose Blood Hydrolysate to Ameliorate LPS-Mediated Inflammation and Oxidative Stress in RAW264.7 Macrophages

This study was designed to isolate an anti-inflammatory activity oligopeptide from goose blood (GBP) for ameliorating LPS-mediated inflammation response and oxidative stress in RAW264.7 macrophages. In this study, GBP was isolated by tangential flow ultrafiltration system (TFUS) combined with size exclusion chromatography (SEC), ion exchange chromatography (IEC), and reversed-phase liquid chromatography (RP-LC), and then identified by liquid chromatography mass spectrometry (LC–MS/MS). The experiment results indicated that the amino acid sequence of oligopeptide with the best anti-inflammatory activity was IIe-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg (IVYPWTQR), which had a molecular weight of 1062.5720 Da, and was derived from haemoglobin subunit beta OS in goose blood. In addition, IVYPWTQR was confirmed to have satisfactory stability and maintained high anti-inflammatory activity in a simulated gastrointestinal digestion. The mechanism by which the IVYPWTQR protected against LPS-mediated inflammation response was attributed to downregulating the TLR4/NF-kB/iNOS pathway. Moreover, IVYPWTQR ameliorated oxidative stress damage in inflammatory state was attributed to activating antioxidant defence system, which was regulated by Keap-1/NRF2/HO-1 signalling pathway for decreasing the accumulation of reactive oxide species (ROS). In summary, these results indicated GBP could serve as a potential functional factor for prevention and improvement of inflammation mediated by LPS and provided an affordable dietary intervention strategy to prevent inflammation.     

质谱技术研究海兔大脑神经节超微量多肽内切酶和酸性多肽酶解产物

采用ESI-Q-TOF质谱分析了南27个氨基酸残基组成的酸性多肽（AP）的一级结构。选用RP-HPLC和MALDI-TOF质谱非在线技术分离与鉴定海兔大脑神经节（CG）多肽与蛋白质的组成与分布，发现CG中含有AP酶解的二聚体短肽。这些短肽序列分别为2（NKDEEQRELLKAISNLL）、2（NKDEEQRELLKAISNL）、2（SGVSLLTSNKDEEQREL）和2（LTSNKDEEQRE LL），均以L-R（氨基酸残基）方式断裂。以AP为探针，结合MALDI-TOF质谱分析技术，发现CG中含有超微量的L-R多肽内切酶，其分子量为78218.25Da。本研究中的分析方法也适合于研究其他生物体内超微量多肽及多肽酶分布与功能。     

高速逆流色谱法对当归中石油醚萃取部位化学成分的分离纯化

采用高速逆流色谱法对当归石油醚萃取部位中4个主要化学成分进行分离纯化。选择Arizona溶剂体系作为高速逆流色谱分离的溶剂系统,经过实验条件优化,确定最佳溶剂为:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比6∶0.6∶3∶1)。高速逆流色谱分离时,采用有机相(上相)为固定相,水相(下相)为流动相,正相洗脱,流速为2mL/min,转速为900r/min,检测波长为254nm。当归石油醚萃取部位中的4种化学成分获得较好分离,经高效液相色谱检测,其纯度分别为78.5%、93.2%、98.9%、88.7%。通过1HNMR、IR和质谱分析,鉴别出其中1种化合物为藁本内酯。     

高效离子交换色谱法分离皖南尖吻蝮蛇毒活性组分

采用高效离子交换色谱法对经初步分离的皖南尖吻蝮蛇毒活性成分进行进一步的分离纯化。采用线性梯度洗脱,得到蝮蛇毒活性组分纯品,并用峰面积归一化法计算其含量为４５．４１％左右,纯度在９０％以上。