我国人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸获得成功

去年十一月,我国胜利地完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的合成。这是世界上第一次人工合成了一个具有明确生物活力的核糖核酸,是继我国在世界上首     

人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸的生物活力测定

本文报道了用一种高灵敏度的方法测定人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的生物活力。tRNA_y~(Ala)在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下接受丙氨酸后,用操作简便而回收率较高的酒精沉淀法回收氨酰化产物,最后,在兔网织红细胞裂解液无细胞蛋白合成体系中,测定氨酰化产物中的丙氨酸转移到蛋白质中去的能力——参入活力。这方法不仅可以测定分离纯化的tRNA_y~(Ala)的活力,而且也可以测定经T_4RNA连接酶连接两个半分子后的反应混合物中产物tRNA_y~(Ala)的活力。利用这方法,已成功地测定了微至5—7 pmoles的人工全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力和参入活力两组数据。测定结果表明,全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力是天然分子的51.6—65.6％,是经拆合的天然分子的91.3—106.0％。其氨酰化产物中的[~3H]-Ala在兔网织红细胞裂解液中的利用率为61.6—63.1％,是天然分子的90.6—91.7％,是经拆合的天然分子的97.2—115.8％。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成

本文报道采用有机合成与酶促合成相结合的方法,按照R.Holley等测定又经他人修正的一级结构,人工全合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的工作。我们合成的tRNA_y~(Ala)与天然的tRNA_y~(Ala)具有相同的化学组成(含有全部修饰核苷酸)和结构,并有完整的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,能接受丙氨酸,而且在兔网织红细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去。在进行全合成以前,曾分别进行了两种人工半合成,即将天然的5′半分子与人工的3′半分子和人工的5′半分子与天然的3′半分子进行连接,都取得有生物活力的整分子tRNA_y~(Ala)。据我们了解,这是世界上第一次用人工方法合成的具有生物功能的核糖核酸。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成

核酸和蛋白质是生命活动的最基本物质,没有它们就没有生命。要了解生命现象的本质,就必须了解这两类生物大分子化合物的性质、结构和功能,以及它们之间的相互关系。用     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3'-端十九核苷酸(58-76)的合成

研究了两个低聚核糖核苷酸的3′-端磷酸化方法.以3′-端带磷酸单酯的低聚核苷酸为供体,用T_4 RNA连接酶将AUUC,CGGA,CUCGUCCA和CCAp等按低的供受体摩尔配比(1∶1.1至1∶2),以87～90％的连接率合成了相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端53～76核苷酸顺序的十九核苷酸AUUCCGGACUCGUCCACCAp.     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子(1—35)的合成

本文报道了应用T_4RNA连接酶将酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))5′-半分子中的三个寡核苷酸片段[—13(Ⅰ);14—22(Ⅱ);23—35(Ⅲ)]连接成5′-半分子的工作。由于寡核苦酸片段的纯度高,多核苷酸激酶和T_4RNA连接酶的质量好,采用连续反应的方法,简化了分离步骤,使产物的得率大大提高,二十二核苷酸的连接率是75％,三十五核苦酸的连接率是90％,以第一步反应原料为基数计算,最终产物的总得率是21％。经连接点和末端核苷酸分析,证明它的结构是正确的。将合成的5′-半分子与天然的3′-半分子在T_4RNA连接酶的催化下连接成人工半合成的完整tRNA_y~(Ala),具有接受[~3H]-丙氨酸和将[~3H]-丙氨酸转移到蛋白质中的生物活力。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子(36—76)的合成

本文报告用T_4RNA连接酶将相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))3′-半分子(36—76)的三个寡核昔酸大片段——10(36—45)(Ⅰ),12(46—57)(Ⅱ)和19p(58—76)(Ⅲ)——从3′-端向5′-端延伸逐个连接合成了这个tRNA的3′-半分子(36—76)。首先在供受体配比为1:1.5的情况下,采取三步连续反应,即19p(Ⅲ)的5′-磷酸化,然后与12(Ⅱ)的连接和连接反应产物的5′-磷酸化等反应,一次制备分离的方法,以70％的总得率合成了5′-磷酸化的三十一核苷酸(46—76)(Ⅳ)。然后,以(Ⅳ)作为下一步反应的供体和三倍量的10(Ⅰ)连接,以67％的产率合成了具有四十一核苷酸的tRNA_y~(Ala)的3′-半分子(36—76)(Ⅴ)。将这个合成的3′-半分子,5′-磷酸化以后,与天然的5′-半分子连接,人工半合成了tRNA_y~(Ala)整分子,经生物活力测定,这个人工半合成的tRNA_y~(Ala)具有接受[~3H]-丙氨酸、并能将接受的丙氨酸转移到蛋白质分子中去的生物活力。     

核酸化学研究 Ⅲ.酵母丙氨酸转移核糖核酸TψC臂ApUpUpC、CpGpGpA和ApUpUpCp的合成

本文报道了带保护基的四核苷三磷酸(Bz)A_(bzp)~(bz)U_(bzp)U_(bzp)C_(Bz)~(bz),(9),(Bz)A_(bzp)~(bz)U_(bzp)C_(bzp)~(bz)U(Bz_2(15),C_(bzp)~(bz)G_(ibup)~(ac)G_(ibup)~(ac)A_((Bz)_2)~((bz)_2)(24)和四核苷酸(Bz)一A_(bzp)~(bz)U_(bzp)U_(bzp) Cv_(bzp)~(bz)(29)的合成。三个四核苷三磷酸均用相应的二核苷二磷酸和二核苷一磷酸,即化合物9由(Bz)A_(bzp)~(bz)U_(bzp)(4)和U_(bzp)C_((Bz)_2)~(bz)(8),化合物15由4和C_(bzp)~(bz)U(Bz)_2(14),化合物24由(McOTr)C_(bzp)~(bz)G_(ibup)~(ac)(19)和G_(ibup)~(ac)A_(Bz)_2~((bz)_2)(23)缩合而得。四核苷酸(Bz)A_(bzp)~(bz)U_(bzp)U_(bzp)C_(bzp)~(bz)(29)由化合物4和二核苷酸U_(bzp)~(bz)(28)缩合而成。四者均用二环己基碳二亚胺为缩合剂。化合物9、15、24和29在去保护基、纯化后分别得到纯的ApUpUpC(10)、ApUpCpU(16)、CpGpGpA(25)和ApUpUpCp(30)。在反应后处理条件和二乙基氯乙基纤维素柱层析条件下,对化合物G_p~(ac)、G_p~(ibu)、G_(acp)~(ac)、G_(ibup)~(ac)、G_(bzp)~(ac)和G_(ibup)~(ibu)上的酰基保护基的稳定性作了比较。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸双氢尿核苷(D)环区九核苷酸(14-22)的合成

用有机合成或酶促合成的AGDCGG为受体,以过量的pDAGp为供体,应用T_4RNA连接酶,成功地合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的双氢尿核苷(D)环区九核苷九磷酸AGDCGGDAGp.在脱去3’-端磷酸基团后,得九核苷八磷酸.产物经序列分析证明,与AGDCGGDAG完全符合.本文也进行了相应于D环区九核苷酸的组成片段AG,AGDC,GG,GGp和DAG的5’-磷酸化和它们之间连接的条件探索,发现了3’-DMP和DAG的5’-磷酸化需在5～10℃下进行,可获近定量的产率. AGDCGGDAGp已用于tRNA_y~(Ala)的全分子合成.     

水杨酸荧光增强法测定酵母核糖核酸

核酸是生物体内重要的生物大分子,定量测定核酸是研究核酸的基础,由于核酸内源荧光很弱,直接利用荧光技术来研究核酸的结构和性质受到限制.     

吖啶橙共振光散射法测定酵母核糖核酸

在pH 11.2的B-R缓冲溶液中,吖啶橙与酵母核糖核酸形成缔合物,使酵母核糖核酸的共振散射增强。体系的最大散射波长为333nm,酵母核糖核酸的质量浓度在0.05~15.0mg·L-1范围内与共振散射增强强度(ΔI)呈线性关系,检出限(3s/k)为0.017mg·L-1。据此,提出了一种简单而快速测定酵母核糖核酸的方法。应用此方法测定2个空白合成样品中酵母核糖核酸的含量,测得平均回收率为99.0%,平均相对标准偏差(n=5)为1.3%。     

人工合成的水蛭素基因在酵母中的表达

本文按水蛭素HV2的氨基酸序列,设计并合成了水蛭素基因,并在酵母α因子表达系统中表达。通过诱变得到的稳定携带水蛭素表达质粒的酵母菌株,在丰富培养基中培养36—48 h后,可在培养液中测得10—20 ATU/ml的分泌的水蛭素表达产物。经过较简单的纯化步骤,得到HPLC纯的水蛭素,其N-端氨基酸序列与天然产物完全相同,并有强烈的抗凝血和抑制凝血酶的活力。从500 ml培养液中可得到约3000 ATU的纯水蛭素,其比活力为6600 ATU/mg。     

亚甲基蓝与酵母核糖核酸相互作用的电化学研究

亚甲基蓝(methylene blue,MB)是一种具有平面结构(结构式见图1)的碱性生物染色剂,在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史,可用于亚硝酸盐、磺氨类、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒药。电分析化学中常被用作氧化还原指示剂或电子媒介体,其在水溶液中的电化学行为曾被深入地研究[1-2]。在水溶液中,MB的还原态为无色中性分子,而氧化态MB 为一价阳离子,由于分子中环平面和氮杂原子上甲基的存在而具有一定的疏水性。水溶液中MB容易形成二聚体,在电极上发生两个连续的1电子转移反应(EE mechanism)[1],其氧化还原电位的峰距ΔEp介于1电…     

酵母核糖核酸与中性红相互作用及电化学检测

采用循环伏安法对酵母核糖核酸与中性红的相互作用进行了研究。NR在玻碳电极上有一对氧化还原峰,加入yRNA后,氧化还原峰电流降低,但没有新的氧化还原峰出现,表明NR与yRNA发生了较强的相互作用,紫外光谱进一步证实该作用方式为静电作用。求得NR与yRNA的结合比为1∶2,建立了一种间接检测酵母核糖核酸的电化学方法,检测范围为5.0×10-3~0.25 g/L,检出限达1.0×10-5g/L。     

酵母核糖核酸的UV-Vis光谱探针反应的机理研究

采用UV－Vis分光光度法，研究在pH7－8的缓冲溶液中，酵母核糖核酸（RNA）与3－氨基－6－二甲氨基－2－甲基吩嗪盐酸盐（ZR）相互作用；反应生成红色配合物，该配合物的最大吸收波长为540nm；反应前后的吸收光谱变化明显，配合物的吸收峰与试剂本身比较红移90nm；研究了体系的酸度、温度、时间等基本反应条件以及不同类型的离子对体系的影响，发现离子强度的改变对体系的吸光度有明显的影响。     

酵母丙氨酸tRNA类似物的合成及其生物活力的测定

在体外系统中,T 7-RNA聚合酶转录编码酵母丙氨酸tRNA及其半分子的DNA,获得不含修饰核苷酸的酵母丙氨酸tRNA及其5’半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸).在T4-RNA连接酶的催化下,不含修饰核苷酸的5'半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸)分别与天然的3'半分子(36-75位核苷酸)和5'半分子(1-36位核苷酸)连接成tRNA类似物.用以上方法得到了酵母丙氨酸tRNA的3个类似物:(1)tRNA的5'半分子不含修饰核苷酸;(2)tRNA的3'半分子不含修饰核苷酸;(3)整个tRNA分子不含有修饰核苷酸.在鼠肝氨酰tRNA合成酶系统中测定tRNA接受丙氨酸的活力,在兔网质无细胞蛋白质合成系统中测定tRNA将丙氨酸参入蛋白质的活力.结果是:5'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低52％,而参入丙氨酸的活力基本不变;3'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低79％,参入活力降低57％;整个分子不含修饰核苷酸者接受丙氨酸的活力降低85％,参入活力降低47％.这些结果说明修饰核苷酸,尤其是3'半分子的修饰核苷酸与tRNA的接受活力和参入活力间有密切的关系.     

酵母核糖核酸在碳纳米管修饰电极上的电化学行为及其分析测定

研究了酵母核糖核酸（yRNA）在碳纳米管（MWNT）修饰电极上的电化学行为，优化了测定参数，在此基础上建立了一种直接测定yRNA的电分析测试方法。yRNA在碳纳米管修饰电极上于磷酸盐缓冲溶液中在0．758V处产生不可逆的氧化电流峰，峰电流与yRNA的质量浓度在1～10mg／mL之间有良好的线性关系，线性回归方程为：Iρ=0．0813ρ＋0．1807，相关系数r为0．9980，检出限为0．6mg／mL。     

NMR探测苯丙氨酸转移核糖核酸中镧离子的键合

用ＮＭＲ谱研究了溶液中镧离子对苯丙氨酸转移核糖核酸（简称ｔＲＮＡＰｈｅ）结构和构象变化的影响。研究表明Ｌａ３＋对ｔＲＮＡＰｈｅ亚胺质子范围的１ＨＮＭＲ谱具有特殊的影响，位于扩大二氢尿嘧啶螺旋（Ｄ螺旋）的端梢三级碱基对Ｇ１５·Ｃ４８明显受Ｌａ３＋的影响（向低场位移０３５）；堆积在Ｇ１５·Ｇ４８上的Ｕ８·Ａ１４碱基对在存有１～２个Ｍｇ２＋时亦受Ｌａ３＋的影响。酵母ｔＲＮＡＰｈｅ中可能受到Ｌａ３＋影响的另一亚胺质子为Ｇ１９·Ｃ５６三级碱基对，由于Ｇ１９·Ｃ５６的亚胺质子共振位于高度叠加的１２６～１２２之间。该碱基对有助于Ｄ环对ＴΨＣ环的联接。Ｌａ３＋引起ｔＲＮＡ分子构象的变化并且导致一些谱峰向高场或低场位移。     

金刚石的人工合成

自从 A.拉瓦锡(Lavoisier)(1792年)和 S.(?)南脱(Tennant)(1797年)证明金刚石和石墨是碳的同素异形体以后,人们对于如何将石墨转变为稀有的金刚石感到了很大的兴趣。但是达种努力直到近年来才获得成功。金刚石的人工合成不但在实际应用方面有着重大的意义,而且在基础理论方面的研究亦系饶有兴趣的问题。过去人们推想天然金刚石可能系碳在地层中受高温高压作用而形成的结晶体。因此,H.莫桑(Moissan)曾将碳粒投入熔融的金属铁中,然后用冷水将此金属铁溶液急速冷却使产生强大的收缩压力,再将外层铁溶去后,得到少量透明的其某些光学性质类似于金刚     

人工合成神经的设想

人们对于神经系统的疾病早就有所认识,并与之作了不懈的斗争。现在研究表明,神经传导的是峰形脉冲电信号,而产生这种信号的原因是由于神经元细胞膜内、外的膜电位在受刺激时发生突变乃至逆转而产生的动作电位;神经元与神经元之间的联络,则是通过化学物质——乙酰胆碱的作用。根据这些情况,我们可以考虑合成人工神经。