在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）．利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ＰＥＸ．ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表达具有明显的抑制作用，从而为在真核水平上利用反义ＲＮＡ对Ｘ基因进行调控的研究提供了有利的基础．     

一种具高活性的酪氨酸酶基因启动子片段的分离

利用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体,经ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ完全消化后与ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ部分消化的嗜麦芽假单胞菌染色休ＤＮＡ进行体外连接,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞,在含氨苄青霉素（Ａｐ）和氯霉素（Ｃｍ）的选择平板上筛选转化子．从随机挑选的５４株转化子中,获得一株抗氯霉素水平达１０００ｍｇ／Ｌ的转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ,所含重组质粒被命名为ｐＡＳＩ．经限制性酶切分析和杂交分析表明,ｐＡＳＩ质粒上插入了一段来源于嗜麦芽假单胞菌染色体的ＤＮＡ片段,其大小为１．４ｋｂ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明转化子Ｅ．ｃｏｌｉＰＡＳＩ在含Ｃｍ的培养基上,额外表达了一条２２×１０３的ＣＡＴ蛋白质带．将重组质粒ｐＷＳＹ上的嗜麦芽假单胞菌ｍｅｌ基因亚克隆到ｐＡＳＩ上１．４ｋｂ启动子功能片段下游,构建成Ｅ．ｃｏｌｉＡＷＳ工程菌株,使黑色素产率提高了７０．６％．     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从层理鞭枝藻总 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增藻红蓝蛋白 α亚基脱辅基蛋白的基因（ｐｅｃ Ａ）, 将ｐｅｃ Ａ 克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ,然后将ｐｅｃ Ａ 基因插入表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｄ,形成的重组质粒在 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）中获得了高效表达,表达蛋白形成包涵体．高效表达的蛋白质的分子量为１９×１０３ ,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白     

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．     

猪瘟病毒石门株E2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了猪瘟病毒石门株的Ｅ２基因．扩增片段大小为１１８４ｂｐ，与预期大小一致．经ＳａｃＩ酶切和巢式ＰＣＲ证实了Ｅ２基因的特异性．将Ｅ２基因扩增片段首先克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中，进行全序列测定，将该基因再克隆到表达载体ｐＢＶ２２１．采用温控诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示Ｅ２基因获得表达．ＥＬＩＳＡ表明Ｅ２基因表达产物可与猪瘟阳性血清起特异性反应．     

小鼠B7-1cDNA克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法,从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后,插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１,经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与文献报道一致．通过脂质体介导将ｐＣＤ－ｍＢ７．１导入Ｂ７－１的小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６（Ｆ０）中,经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＮＡ斑点杂交初步证实Ｂ７－１在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达．同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用ＬＤＨ释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性,结果显示,与野生型和模拟转染的Ｂ１６细胞相比,Ｂ７－１基因转染的Ｂ１６细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型Ｂ１６细胞的特异杀伤活性（ｐ＜０．０２）．这说明,将Ｂ７－１基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性,诱导有效的抗肿瘤免疫反应     

家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋白的表达

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,通过同源重组得到整合了ｌａｃＺ／Ｔｎ７ａｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ,除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外,还能感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许细胞Ｓｆ９,成功地构建了ＢｍＮＰＶ的双穿梭载体．经与重组转座质粒ｐＦＧＨｅ转座,获得了插入ｇｆｐ／ＨＢＶｅ融合基因的重组ｒＢｍ－Ｂａｃｍｉｄ（ｒＢｍＧＨｅ）,在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有ＨＢｅＡｇ抗原性的双功能融合蛋白．Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ为杆状病毒ＢａｃｔｏＢａｃ策略增添了一个新成员     

全长和截短的δ内毒素cryIAc基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

在昆虫病毒转移载体ＰＶＬ１３９３多角体基因启动子下游克隆了全长的苏芸金杆菌δ内毒素基因ｃｒｙＩＡｃ，得到了重组转移载体ｐＴｈＹ１，用ＫｐｎＩ将ｃｒｙＩＡｃ基因进行了截短，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ２．随后在两种重组转移载体ｃｒｙ基因的下游引入了ＩＥ１启动于驱动的ｎｅｏ基因作为筛选标记和ＳＶ４０小ｔ抗原终止区作为ｃｒｙ基因的终止信号，得到了重组转移载体ｐＶＬＹｌｎｅｏ和ＰＶＬＹ２ｎｅｏ，分别用两种重组转移载体ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染昆虫Ｓｆ９细胞，用Ｇ４１８筛选后经有限稀释法纯化，得到了携带全长和截短。ｒｙＩＡｃ基因的两种重组病毒ｖＶＬＹ１ｎｅｏ和ｖＶＬＹ２ｎｅｏ，分别在昆虫细胞中表达了分子量为１３３３００和８２０００的ｃｒｙ蛋白，大小分别与ｃｒｙＩＡｃ晶体蛋白和预计的截短蛋白相同，并均具有与原晶体蛋白相同的免疫活性，生物测定表明两种表达产物均具有杀虫活性，和昆虫病毒一起产生协同增效毒性．     

温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８,构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５,该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签,利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ 基因的１１４８１８５７ 编码序列分别插入到ｐ Ｖ Ｖ５ｂ、ｐ Ｅ Ｔ２８ｂ 的相应位点,构建了重组表达质粒 ｐ Ｅ Ｇ１ｂ、ｐ Ｂ Ｇ７ｂ,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的 ４２％ 和２８％ 表达产物为融合蛋白并主要以包涵体的形式存在 该蛋白 Ｎ 端与含６ 个组氨酸在内的３０ 个氨基酸残基的多肽相连,利用 Ｉ Ｍ Ａ Ｃ金属螯和层析柱,对包涵体中的重组ｐ２４ 蛋白进行纯化, 其纯度超过 ８０％ ;对上清中的可溶性ｐ２４ 蛋白进行纯化,产物最终纯度超过６７％ 纯化后的重组蛋白可与 Ｈ Ｉ Ｖ１ 型标准阳性血清发生较强的免疫学反应     

伪狂犬病毒表达载体的构建

利用伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）湖北地方株胸腺核苷激酶（ＴＫ）基因和ｇＧ糖蛋白基因启动子（ＰｇＧ），构建了ＰＲＶ基因转移载体．通过β－半乳糖苷酶基因确定ＰｇＧ控制下外源基因的表达并筛选出表达β－半乳糖苷酶的ＰＲＶ重组病毒．采用ＰＣＲ对重组病毒进行了初步鉴定，证实外源基因可由构建的转移载体导入病毒ｔｋ基因中，重组的ＰＲＶ湖北地方株可用于表达外源基因．     

果蝇heix基因启动子的分析及其转录活性鉴定

采用生物信息学的方法,综合运用启动子预测工具Promotor Scan1.7和BDGP(neural network pro-moter prediction)分析了目标序列的启动子特征,以果蝇基因组DNA为模板扩增出heix基因启动子候选序列连接至pMD19T载体,构建了荧光素酶报道基因重组质粒pHeixpromoter-Luc,转染果蝇S2细胞表达荧光素酶,并测定了荧光素酶的活性.预测出4个候选的heix基因启动子序列,发现存在ATF、MLTF、c-fos_US5等多种转录因子调控基序;成功构建了pMD19T-Heixpromoter和pHeixpromoter-Luc重组质粒.与肌动蛋白启动子(actinp romoter)相比,pHeixpromoter-Luc表达出的荧光素酶也有较强的活性.本研究找到了果蝇heix基因启动子候选序列,并发现多种转录调控元件,其荧光素酶报告基因实验说明果蝇heix基因启动子与肌动蛋白启动子有相当的转录活性.     

pEGFP-MEK1/Q56P重组质粒的构建及融合基因在293T细胞中的表达

构建第56位氨基酸发生突变的MEK1基因(MEK1／Q56P)与增强绿色荧光蛋白(EGFP)报道基因融合表达的真核重组质粒pEGFP-MEK1／Q56P，经限制性酶切及测序鉴定后，将其导入293T细胞中，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，同时进行Western blot检测。酶切鉴定及测序结果表明构建的pEGFP-MEK1／Q56P与预期结果一致，荧光观察及Western blot结果表明MEK1／Q56P和EGFP在293T细胞中能以融合蛋白的形式表达，且MEK1／Q56P能特异性活化ERK1／2，本研究成功构建了含有MEK1／Q56P的绿色荧光蛋白真核表达质粒，便于对Raf／MEK1／ERK1／2信号传导通路做进一步研究。     

稳定干扰AGR2乳腺癌细胞系的建立及其功能

将AGR2基因的shRNA表达序列连接到pSUPER质粒中,获得pSUPER-shAGR2质粒,经测序鉴定后,将pSUPER-shAGR2和pSUPER质粒通过Lipofectamine2000转染MCF7细胞,经流式细胞仪和600μg.mL-1G418筛选获得稳定干扰AGR2的MCF7细胞系和对照细胞系,Western blot检测其RNA干扰效果,MTT检测细胞     

稳定表达egfp基因细胞的构建与克隆

将增强的绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent pprotein,EGFP）基因插在HCMV（humancytomegolovirus）启动子下游,构建了表达质粒pCA13-eG,用脂质体Lipofectin介导分别转染HeLa细胞、Vero细胞,仅通过细胞传代,就最能稳定高效表达EGFP的绿色细胞,比较发现,质粒pCS13-eG转染后,产生能高效表达EGFP的HeLa细胞其比率高于Vero细胞;EGFP高效表达对Vero细胞的毒性大于对HeLa细胞的毒性,本研究表明,绿色细胞轮廓清晰,由于其特有的性质,在用于细胞的形态观察、细胞分裂等研究时会有所作为。     

一个新的肿瘤相关基因-CYP2C 1 9

细胞色素Ｐ４５０ ２Ｃ１９（ＣＹ２Ｃ１９）又称为Ｓ－美芬妥英羟化酶,它的两个突变型等位基因ＣＹＰ２Ｃ１９ｍ１和ＣＹＰ２Ｃ１９ｍ２是引起ＣＹＰ２Ｃ１９酶活性缺陷的原因,运用等位基因特异扩增法（ＡＳＡ）对肺癌患者、膀胱癌患者及正常人进行了ＣＹＰ２Ｃ１９基因分型研究,以探索ＣＹＰ２Ｃ１９酶活性与肺癌、膀胱癌易患性的关系,经过对７４例肺癌患者、５０例膀胱癌患者和７０例对照组的测定,发现肺癌组慢代射的发生率     

HCVNS2基因表达载体的构建及在E.coli中表达

PCR人含有丙肝病毒全长非结构蛋白的载体pBlueBac25中扩增出全长的NS2基因DNA片段,分别克隆到表达载体pQE30和转座载体pFasBacHTb的多隆位点（MCS）,PFastNS2通过转座插入穿梭载体Bacmid的表达盒;pQENS2转化JM109菌株,诱导表达出N端含有6个His的全长His的全长NS2蛋白,用Ni-NTA-agarose柱层纯化,获得提纯的全长NS2蛋白。     

产黑色素B.thuringiensis重组菌株的构建及其培养条件的优化

将嗜麦芽假单胞菌中产生黑色素的基因(mel gene)克隆到穿梭载体pHT3101中，并将它处于表达系统cry3A的控制下，构建得到重组质粒pHTAM．将此重组质粒用电脉冲的方法转入苏云金芽胞杆菌受体菌株BMB171中，得到重组菌株RSA．研究结果表明，处于cry3A控制下nel基因在BMBl71菌株中得到了成功的表达．本研究进一步采用红外光谱扫描法检测RSA所产黑色素的性质，并通过改变培养条件来提高黑色素的产量．     

bop基因及其上游启动子的克隆与表达

应用重组PCR的方法，直接从盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)S9的基因组DNA上扩增到了编码细菌视紫红质(bacteriorhodopsin)的基因——bop基因及其启动子部分(1196bp)，并将其克隆到表达载体pXLNovR后，在宿主菌株中得到了表达．测序结果表明，扩增得到的片段与NCBI数据库中的bop基因及启动子的序列完全相同，且其表达产物的分子量与野生型BR蛋白的分子量一致，并且在568nm处表现出BR蛋白特征吸收峰．本方法与其他方法(如逆转录PCR，建立基因文库后从中调取等方法)相比具有操作简便，成功率高的优点．     

用原位PCR方法检测培养细胞中的单拷贝SRY基因

以原位ＰＣＲ方法在培养的ＨＩＣＭＡ细胞中进行了Ｙ染色体上单拷贝ＳＲＹ基因的原位扩增，并使用ＰＣＲ方法制备的地高辛标记探针原位检测了所扩增的片段．比较研究表明，原位ＰＣＲ法较之直接的原位杂交法，其灵敏度提高５倍以上     

一种水稻愈伤组织特异性启动子的克隆及其应用

筛选标记基因是一种用于植物遗传转化后阳性转化子筛选的有效手段,但目前介导标记基因表达均采用组成性启动子.这些启动子虽然在植物遗传转化得到了广泛应用,但由于是组成性表达,在转基因的生物安全性存在标记基因的安全性担忧.为了克服这一缺点,本文从水稻基因组内克隆了水稻半胱氨酸蛋白酶基因(Cyctein protease,CP)的启动子,通过gus转基因的验证,该启动子只在愈伤组织表达,不在水稻根、茎、叶等组织表达,为愈伤组织特异性表达启动子(Callus-specific Promoter,CSP).将该启动子用于介导筛选性标记基因的表达,通过对筛选性标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的密码子优化,明显提高了CP启动子在水稻转基因选择的转化效率,质粒转化效率和阳性植株率均达到了pCAMBIA1301的35S启动子介导标记基因hpt的选择效果.