半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

虹鳟腺苷酸转移酶基因2(ant2)cDNA克隆与蛋白结构分析

腺苷酸转移酶(ANT)是位于线粒体内膜上参与能量分子传导的转运蛋白,在细胞凋亡调控网络中发挥重要作用.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼ant2基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591153).该序列全长1276 bp,其中5'端非翻译区长66 bp,3'端非翻译区长316 bp,开放性阅读框长894 bp,编码297个氨基酸.该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域和3个转膜区.通过与其他脊椎动物腺苷酸转移酶蛋白序列的比较,发现该基因具有高度保守性,氨基酸序列的同源性均在90%左右.同源模建显示其与牛的线粒体ADP/ATP载体,chain A蛋白有相同的孔洞(cavity)结构.     

桔全爪螨几丁质合成酶基因克隆与序列

以桔全爪螨Panonychus citri(MeGregor)为研究对象,利用RT-PCR和SMART RACE技术克隆获得其几丁质合成酶基因的全长cDNA序列(命名为PcCHS,GenBank登录号为KM242063),并利用生物信息学方法对序列进行分析。结果表明:桔全爪螨几丁质合成酶PcCHS基因的cDNA全长为4 925bp,其中5’非翻译区(5’-UTR)为155bp,3’非翻译区(3’-UTR)为345bp,开放阅读框(ORF)包含4 425bp,编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.43kD,理论等电点为6.83。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。ExPASy在线分析表明,PcCHS具有15个跨膜螺旋、4个糖基化位点。推导的氨基酸序列同源性分析结果表明:桔全爪螨与二斑叶螨相似度为89%,其次为西方盲走螨,相似度为55%。分子系统进化的结果也表明桔全爪螨与二斑叶螨和西方盲走螨的进化关系最近。     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP70基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列。用半定量PCR方法研究了HSP70mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况。结果表明:HSP70cDNA全长为2 664bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1 917     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

凡纳滨对虾亲环素A基因的克隆及表达分析

通过电子克隆所得基因序列设计引物,采用RT-PCR方法首次克隆得到长度为885 bp的凡纳滨对虾亲环素A（Cyclophilins A）CYPA基因cDNA序列,其开放阅读框为35~529 bp,可编码164个氨基酸.推算其分子量约为17.6×103,理论等电点为8.55.与其他物种的CYPA基因比对发现,该基因的氨基酸序列具有较高的保守性.基于氨基酸序列的聚类分析表明,凡纳滨对虾与斑节对虾的亲缘关系最近.荧光定量PCR的结果显示该基因在组织中广谱表达,在抗病组中,胃中的表达量最高,心脏中的表达量最低,差异约为2倍.而在感病组中,该基因在心脏中的表达量最高,肌肉中的表达量最低.利用ProtFun在线预测蛋白质的功能分类,表明CYPA基因可能是一免疫应答抑制因子,参与凡纳滨对虾免疫防御反应.     

RACE法克隆黑曲霉NCU-317中α-L-鼠李糖苷酶基因与生物信息学分析

实验室前期筛选得到一株能够产α-L-鼠李糖苷酶的黑曲霉NCU-317,但由于其完整产酶序列未知,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和改良cDNA末端快速扩增(RACE)法,以克隆得到的黑曲霉NCU-317 cDNA为模板,成功克隆得到其α-L-鼠李糖苷酶基因全长。克隆得到α-L-鼠李糖苷酶基因共3 018 bp,其中含有2 748 bp的完整开放阅读框,5’非编码区长为216 bp,3’非编码区长为54 bp。经过对序列的生物信息学分析显示:编码蛋白由915个氨基酸组成,预测理论分子量为103.94 kD,等电点为5.59;蛋白质二级结构以无规则卷曲为主;将氨基酸序列输入UniProt比对后发现,黑曲霉NCU-317的产酶序列与黑曲霉A0A254UAG7同源性最高,达到了99.6%。     

水稻RUBPCase 小亚基基因(rbcS)全长cDNA的克隆和分析

根据国际核酸数据库中不同植物的RuBPCase小亚基基因(rbcS)保守序列设计PCR引物,首先扩增出约350bp的cDNA短片段,以此作为分子杂交探针对构建的水稻cDNA文库进行杂交筛选,同时结合PCR分析确定阳性克隆中cDNA片段的大小,选取插入的cDNA片段最长的阳性克隆进行测序分析验证,从而克隆了水稻中编码RuBPCase小亚基的全长cDNA(GenBank登记号:AY445627).该cDNA片段从第52 bp开始至579 bp含有编码175个氨基酸的开放阅读框(ORF,GenBank登记号:AAR19268.1)和一个终止密码子.AY445627在3'端有一个长264bp的非编码区,而在3'末段有poly(T)17·经Compute pI/Mw软件预测,AAR19268.1的等电点pI和分子量Mw分别为9.03和1 9630.66 Da.通过与国际核酸和蛋白质数据库的blast比较分析,AY445627序列与GenBank登记号D00644.1(水稻rbcS)、U43493.1(大麦rbcS)、AF104250.1(燕麦rbcS)和M37477.1(小麦rbcS)的序列相似性分别为99%(650/655)、84%(436/515)、84%(427/506)和84%(386/456).而AAR19268.1氨基酸序列与GenBank登记号P18566(水稻rbcS)、AAF07947.1(燕麦rbcS)、BAA35162.1(大麦rbcS)和BAB19812.1(小麦rbcS)的氨基酸序列相似性分别为98%(173/175)、84%(143/169)、84%(140/166)和83%(144/173).生物信息学的分析还表明rbcS基因不仅在水稻不同品种基因型之间非常保守,而且在水稻、小麦、大麦和燕麦等禾本科不同物种之间也高度同源.     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

三角褐指藻DGAT1基因生物信息学分析及表达调控研究

本研究采用转录组测序获得了三角褐指藻DGAT1基因cDNA全长序列(GeneBank登录号: 7200924), 并对其进行生物信息学分析和表达调控研究. 结果表明, 三角褐指藻DGAT1基因cDNA序列全长为1438bp, 开放阅读框(ORF)为1098bp, 编码365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG结合位点(II)等功能结构域. 预测三角褐指藻DGAT1蛋白为亲水性蛋白, 含有6个跨膜结构域和7个超强跨膜螺旋区, 无信号肽. 进化树分析表明, 三角褐指藻与海链藻DGAT1蛋白同源性最高. RT-qPCR结果表明, 光照强度和温度均显著促进三角褐指藻DGAT1基因的表达. 随着光照强度和温度的增加, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量呈先升高后降低趋势, 在光照强度为2500lx或温度为25℃时, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量达到最大, 这与三角褐指藻总脂含量的变化趋势一致, 同样揭示DGAT1蛋白与三角褐指藻总脂生物合成与积累密切相关.