三角梅SRAP-PCR反应体系的建立及引物筛选

利用L9(34)正交试验设计,对影响PCR反应的TaqDNA聚合酶量、dNTP浓度、Mg2+浓度和引物浓度4个因素以及模板DNA浓度进行了三角梅SRAP-PCR扩增反应条件优化研究,并对引物进行了全面筛选.三角梅SRAP-PCR优化反应体系结果为:2.5μL 10×PCR buffer、60ng模板DNA、TaqDNA聚合酶1.0U、dNTP 0.25mmol/L、Mg2+2.5mmol/L、引物0.3μmol/L,总体积25μL.运用该结果从208对引物组合中共筛选出扩增条带清晰,多态性丰富的SRAP引物27对.优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用SRAP标记技术进行三角梅遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础.     

太行菊SRAP-PCR反应体系的建立与优化

相关序列扩增多态性（SRAP）是一种新发展起来的分子标记技术,在太行菊中还未见相关的报道。为建立优化适合太行菊SRAP分析的扩增体系,以太行菊DNA为模板,对影响SRAP-PCR反应体系的5个重要参数设置梯度进行单因素实验分析,以确定最佳的反应条件。经过大量的重复性实验确定了适合太行菊SRPA-PCR反应体系：20μL的反应体系中,模板DNA量50ng,1.25mmol/L的Mg2＋浓度,0.5μmol/L的上下游引物,0.2mmol/L的dNTPs以及Taq酶1U。该体系在太行菊个体中均能扩增出清晰稳定的条带,为后续的太行菊遗传多样性分析奠定了基础。     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立

以油茶品种大别山2号和赣兴46为试验材料,利用Me5Em8正反向引物组合进行了SRAP-PCR反应体系的L9(34)正交试验,采用正交设计直观分析及方差分析对影响SRAP反应的Taq聚合酶、Mg2+、dNTP和引物浓度进行分析,并对模板DNA浓度进行了单因素试验分析。结果表明,油茶SRAP-PCR 20 μL反应体系的最佳组合为: Taq聚合酶1.20 μmol/min、Mg2+浓度125 mmol/L、dNTP浓度0.15 mmol/L、Primer浓度0.60 μmol/L、模板DNA含量60 ng,并含有2 μL 10×buffer(Mg2+ free)。各因素对油茶SRAP-PCR反应的影响大小依次为:dNTP、 Mg2+ 、Taq聚合酶、Primer。     

大白菜EST-SSR反应体系优化及引物筛选

 探讨了大白菜EST-SSR反应体系的优化,利用优化的体系筛选部分引物。采用L16(44)正交设计,研究各主要参数的适宜浓度,建立适合大白菜EST-SSR反应的最佳体系。结果表明,各因素不同水平浓度对扩增结果均有一定影响,其中以引物浓度影响最大,其次是dNTP和Taq DNA聚合酶,最小是模板DNA用量。优化后的最佳体系（20?滋L）为：引物浓度1.0μmol/L,dNTPs 0.25mmol/L,Taq酶0.5U,模板DNA 70ng。利用优化的体系,根据大白菜EST序列设计引物126对,分别以2对抗、感病毒病的大白菜材料的基因组DNA为模板进行扩增,筛选出至少在一份材料中扩出多态性的引物19对。该优化体系可用于大白菜EST-SSR扩增,初步筛选的引物可用于大白菜病毒病分子标记的进一步研究。     

水稻SRAP-PCR体系的建立与优化

对影响水稻SRAP-PCR扩增结果的模板质量浓度、dNTP Mixture浓度、Mg2+浓度以及引物、反应程序进行了探索,获得在使用大连宝生物Taq酶时能够稳定扩增水稻基因组的SRAP-PCR体系:在25μL体系中,合适的模板DNA质量浓度为0.8~1.2 ng/μL,Mg2+浓度为2~3 mmol/L,dNTP浓度为0.15~0.20mmol/L,按照Li和Quiros设计的程序或按照“94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存“的程序进行扩增可以得到较为满意的结果.Li和Quiros设计的30对引物均能用于水稻SRAP-PCR.     

利用随机引物对PCR反应条件的筛选及优化试验

不同试验PCR反应的条件是不完全一致的，在PCR反应进行前就有必要对反应条件进行筛选和优化，因此，提出了对关键实验条件的正交筛选，结合反应的增强与抑制条件，从而筛选出适用于本实验室的最佳反应条件。     

扬子鳄胚胎胃PAS反应观察

选取２３例扬子鳄胚胎，对其胃进行ＰＡＳ反应观察．胃表面上皮：第３０天时，上皮细胞表面出现薄层的ＰＡＳ反应阳性物质；第３４～６０天，阳性反应逐渐增强，并出现粘液保护层．胃腺：胃底腺，第４０天腺芽上皮出现ＰＡＳ反应阴性细胞，第４６～６０天胃底腺腺管基部上皮细胞呈阴性反应；幽门腺及贲门腺，第４０天时出现腺芽，腺芽细胞呈阳性反应；第４６～６０天幽门腺及贲门腺腺管基部出现阴性反应细胞．     

真藓(Bryum argenteum)ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定真藓最佳ISSR-PCR反应体系,采用PCR正交实验设计方法,对影响ISSR-PCR试验的模板DNA、引物、d NTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶5个因素在4个水平上进行优化,并对100条引物逐一进行温度梯度PCR,筛选合适的引物并确定每个引物的最佳退火温度.结果显示优化的20μL ISSR-PCR反应体系中包括20 ng/20μL DNA模板、0.45μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg~(2+)、0.4 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/Ld NTPs.利用该体系最终筛选出50条扩增条带清晰,重复性好,多态性高的引物并确定其退火温度.这一体系的建立、引物的筛选及退火温度的确立为进一步利用ISSR分子标记技术对苔藓遗传多样性的研究提供理论基础.     

濒危植物刺桫椤RAPD反应体系的优化

以高盐SDS法提取濒危植物刺桫椤(Alsophila spinulosa)嫩叶总DNA，进行RAPD分析，分别研究了模板DNA、引物、dNTP、Mg^2 和Taq DNA聚合酶用量以及反应体积对反应结果的影响．筛选并建立了适合于利桫椤RAPD扩增的反应体系：反应体积10μL，内含2ng/μL模板DNA，2．0mmo1/L MgCl2,0．3μmo1／L引物，300μmo1／L dNTP，0．5u Taq DNA聚合酶．     

扬子鳄种群的线粒体DNA控制区序列变异性及其对物种保护的启示

测定了来自4个不同地点(包括安徽宣城野生和饲养种群、浙江长兴的饲养种群及在美国的饲养种群)的64个扬子鳄线粒体DNA控制区部分序列.结果共检测出4个单倍型共3个变异位点,与龟类、鸟类、哺乳类及其它鳄类相比较,反央出扬子鳄线粒体区的序列变异性很低.在此基础上,对扬子鳄遗传保护提出了有关建议.     

SRAP和SCAR分子标记应用于中药材研究进展

 分子标记技术是基于生物体基因组的遗传分析方法,在动植物的品种鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子辅助育种等研究中有着广泛的应用。其中相关序列扩增的态性（Sequence-Related Amplified Polymorphism,SRAP）是开发较晚、应用较广的分子标记技术,以其简单、高效、重复性良好的优点,在药用植物的遗传学研究中表现出很大的优势。利用分子标记技术构建药材系统发生树,明晰遗传背景和药材品质的关系,辅助中药材品种选育,研究药材道地性成因是近几年的研究热点。本文介绍了SRAP和序列特征性扩增区域（Sequence Characterined Amplified Regions,SCAR）的技术基础,并总结了SRAP常用引物,比较分析了一些中药材的优化反应体系;综述SRAP在中药材的遗传多样性研究、道地性分析、遗传图谱构建等方面的应用情况;SCAR技术的应用特点和在中药材鉴定中的作用;阐述二者结合在中药材研究中的现状及其应用前景。     

青枯菌SRAP—PCR体系的建立与优化

本研究以马铃薯青枯菌19046为试验材料,应用单因素试验法优化SRAP—PCR反应体系,得出重复性好、带型清晰、稳定性强的最佳反应体系：总体积为10μL,50．g／μL模板DNA0．6μ、10μmol／L引物0．8μL、TapDNA聚合酶1．0U、10mol／L、dNTPs1．0μL．该反应体系可用于青枯菌遗传多样性、基因定位与克隆等的研究．     

怀地黄SRAP分子标记体系的建立与DNA指纹图谱的构建

以怀地黄DNA为模板,进行SRAP反应条件的优化及DNA指纹图谱构建,优化的反应体系为:25μL的体积中,模板DNA 20 ng,Mg2+浓度2.5 mmol.L-1,上下游引物各0.36μmol.L-1,dNTPs 0.30 mmol.L-1,Taq DNA酶2.0 U.构建了怀地黄23个品种的DNA指纹图谱,为怀地黄品种鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种和质量综合评价等研究奠定了基础.     

中国扬子鳄保护存在的主要问题及管理对策研究

在调查分析扬子鳄野生及饲养种群保护现状的基础上,提出了当前中国扬子鳄保护存在的主要问题:野生扬子鳄栖息地岛屿化严重及自然保护区管理体制的缺陷;饲养种群基础设施规模的局限及没有建立完整谱系资料等。同时提出了相应的管理对策:改变保护区的管理体制,恢复扬子鳄丘陵人工湿地型栖息地及建立扬子鳄成片滩涂型湿地栖息地;加大对宣城扬子鳄繁殖研究中心基础设施建设的投入,加快饲养种群的遗传谱系建设,开展扬子鳄种群生存力分析及有效种群大小评估。     

Testing reintroduction as a conservation strategy for the critically endangered Chinese alligator: Movements and home range of released captive individuals

The Chinese alligator (Alligator sinensis) is considered the most critically endangered crocodilian as a result of the near total loss of its habitat and its extremely small and fragmented wild populations. Plans for population recovery lie mostly with wetland res- toration and the reintroduction of captive-reared animals. We carried out a first-trial release of 3 adult Chinese alligators (1♂, 2♀) into a pond at the Hongxing conservation site, Xuancheng, southern Anhui Province; the animals were radio-tracked from May to October in 2003. We hypothesized that after a period of adaptation, the alligators would establish definable home ranges. Two (1♂, 1♀) of the 3 alligators were monitored for the whole of the tracking period. The male had an annual home-range size of 7.61 hm2, and the female 4.00 hm2. Water temperature and pond water level were two important factors influencing the alligators’ distributions, and daily movements. The radio-tracked alligators had overlapping home ranges, which notably included the one substantial island in the pond; that island is the only known nesting site of the local native wild alligators. Aggressive interactions between the released alligators and native wild alligators were observed during the breeding season around this island. All the three reintroduced alligators survived the winter of 2003 and were alive in the same pond in 2008. We concluded that the Hongxing conservation site provided a suitable habitat for the reintroduced alligators. However, the low water level in the pond resulting from farmland irrigation in August and September can be a substantial threat to the alligators’ survival. Therefore, regu- lations on irrigation in summer and autumn are needed to balance the water needs of the alligators and agriculture.     

日本沼虾基因片段PCR扩增的条件优化

以日本沼虾肌肉组织为材料,提取其基因组DNA,研究了该虾16S rRNA基因片段扩增的PCR反应条件.经对扩增反应体系中各因子和扩增程序的梯度实验,确定优化反应条件为: 在25μL反应体系中,10×Buffer 2.5 μL,DNA模板200～300 ng,4×dNTP 0.2 mmol/L,Mg²⁺1.5 mmol/L,引物0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,95 ℃预变性5 min;接着35个循环包括95 ℃变性1 min,56 ℃复性50 s,72 ℃延伸1 min;最后72 ℃延伸10 min.应用此优化体系扩增日本沼虾18S rRNA,细胞色素氧化酶亚基I (cytochrome oxidase subunit I, COI),NADH脱氢酶亚基V (NADH dehydrogenase subunit 5, ND5)等基因片段均获得了稳定而理想的效果.研究结果为深入探讨日本沼虾种群的遗传和变异,以及开展其种质鉴定和分子标记等研究提供了参考.