磷酸化蛋白质分析技术在蛋白质组研究中的应用

磷酸化修饰蛋白质的分析是蛋白质组研究中的重要内容。对于目前磷酸化蛋白质分析所涉及的各种方法,包括放射性同位素标记,抗体免疫印记等传统方法和以串联质谱各种扫描技术为基础,结合亲和提取、液相色谱-质谱联用等手段的新技术、新方法,以及这些技术在磷酸化蛋白质组学中的应用予以评述。     

大肠癌组织棕榈酰化修饰蛋白的组学分析

蛋白质棕榈酰化修饰在大肠癌的发生、发展和转移等过程中发挥了重要作用。本研究采用改进的酰基-生物素交换方法(Acyl-biotinyl exchange, ABE),对大肠癌组织中的棕榈酰化修饰蛋白进行富集,并利用蛋白质组学技术对富集的蛋白进行分析鉴定。结果共鉴定出213种高可信度(+HA/-HA>3)的棕榈酰化修饰蛋白,包括烯醇化酶1、过氧化物氧化还原酶、波形蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、核异质性核糖核蛋白K、分子伴侣复合体蛋白1等,并以烯醇化酶1棕榈酰化修饰为例,采用蛋白质印迹技术对其进行了验证。本研究对经典的ABE方法进行了改进,降低了非特异性背景信号,大肠癌癌组织中的棕榈酰化修饰蛋白的鉴定分析结果可为进一步研究特定肿瘤相关蛋白分子的棕榈酰化修饰调控的分子机制、精准发现大肠癌肿瘤标志物或分子靶点提供新思路。     

N-磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法

蛋白质磷酸化修饰在细胞的信号转导、代谢、发育等生命过程中发挥着重要作用。除了研究较为透彻的发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链羟基的O-磷酸化修饰之外,近年来,发生在组氨酸、精氨酸和赖氨酸侧链氨基的N-磷酸化修饰受到了越来越广泛的关注。然而,由于N-磷酸化修饰具有独特的P-N键结构,导致其化学稳定性差。尤其是在O-磷酸化肽段富集常用的酸性条件下,N-磷酸化极易丢失。因此,目前对N-磷酸化蛋白质的研究仍处于初始阶段。该文针对蛋白质N-磷酸化修饰的特点、富集和鉴定方法进行了综述,并对其发展前景进行了展望。     

凝胶电泳-毛细管液相色谱-质谱联用技术分析大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组

通过凝胶电泳将大肠癌患者的手术标本组织(肿瘤与癌旁)中的总蛋白按照分子量分成不同的组分,经胶内水解后,利用毛细管液相色谱-质谱联用技术对各个组分的多肽混合物进行蛋白质组学分析,共鉴定出29种差异表达的蛋白质,其中肿瘤组织中表达上调的蛋白质19种,如Fibrinogen beta chain,Vimentin,Fi-brinogen gamma chain,Histone H2A type 1-B/E,Isoform 1 of Periostin,Fibrinogen alpha chain,Histone H3.1,Al-pha-enolase,Protein disulfide-isomerase A3等;在肿瘤组织中表达下调的有10种蛋白质,如Sarcomeric tropomy-osin kappa,Transgelin,Heat shock protein beta-1,Talin-1,Isoform 2 of Vinculin,Isoform 1 of Filamin-C等.通过蛋白质印迹实验对其中的踝蛋白1(Talin-1)和烯醇化酶(Alpha-enolase)的蛋白质组学鉴定结果进行了验证.生物信息学分析表明在大肠癌组织中表达上调的蛋白多具有胞外分泌的属性,提示这些蛋白很有可能会渗透到机体内的循环系统中,从而在患者血液或者腹水中能够被检测到;而在大肠癌组织中表达下调的蛋白则多为细胞骨架、胞外基质纤维等的组成成分,这些蛋白的下调常与肿瘤细胞向周围组织的侵袭和转移有密切关系.本研究为大肠癌的早期诊断、大肠癌初筛等方面的研究等提供了基础数据,对进一步深入研究大肠癌发病机制具有重要意义.     

基于液相色谱-串联质谱技术的磷酸化蛋白质组学分析

本文运用稳定同位素双甲基化标记技术、固定相金属离子螯合层析(IMAC)技术并结合液相色谱-串联质谱法研究了仙台病毒感染引起的宿主细胞磷酸化蛋白质组变化。实验发现定量的4 289个磷酸化肽段有~20%的蛋白质磷酸化位点发生了显著变化;通路富集分析表明哺乳动物雷帕毒素靶蛋白(mTOR)通路和剪接体(Spliceosome)通路可能参与宿主细胞对病毒的应答;通过对显著变化磷酸化肽段进行基序分析,发现了9个代表性的磷酸化修饰位点基序。本研究方法对于深入解析抗病毒天然免疫信号通路提供了新线索。     

磷酸化壳聚糖膜的仿生复合修饰

仿生构建羟基磷灰石/壳聚糖复合材料是制备骨修复材料的一条有效途径.以甲醛和磷酸为反应试剂,采用均相反应法制备出壳聚糖(CS)的磷酸化衍生物-甲基磷酸化壳聚糖(NPCS).红外光谱、X射线光电子能谱分析结果表明,改性后的CS分子结构和元素组成发生显著变化,偶合等离子体发射光谱测试显示NPCS的取代度可达到0.5左右.用模拟体液(SBF)处理CS和NPCS膜,扫描电镜(SEM)观察和能量色散X射线分析表明,NPCS膜表面沉积了磷酸钙盐.由X射线衍射分析得知,NPCS膜表面形成的是低结晶度的羟基磷灰石(HA).接触角测试结果表明,经改性或修饰后,材料表面的亲水性明显提高.     

酪氨酸磷酸化多肽的化学选择性富集

酪氨酸激酶在生物分子的信号转导中起着非常重要的作用,目前除抗体技术外尚无有效的化学方法能够实现对酪氨酸磷酸化蛋白或多肽的选择性富集,然而抗体通常成本较高,而且往往会有模体序列的选择性识别。本文发展了一种基于化学反应的酪氨酸磷酸化肽段的选择性富集,该方法利用了β消除反应只能发生在丝氨酸和苏氨酸磷酸化多肽的特性,以反相选择方法,从而实现对酪氨酸磷酸化肽段的选择性富集。以标准多肽对其反应效率和回收率进行了考察,20分钟内丝氨酸磷酸化多肽的β消除反应效率可达99%以上,而同时酪氨酸磷酸化肽段可保持70%的回收率。进一步以六种标准蛋白混合物的酶解产物对其进行考察,经β消除反应和亲和富集之后,只有酪氨酸磷酸化多肽可以被检测出来,该方法为蛋白质酪氨酸磷酸化的分析提供了一种新的手段。     

质谱法分析蛇毒蛋白翻译后修饰

采用SDS-PAGE分离大连黑眉蝮蛇(Gloydius Shedaoensis)蛇毒蛋白组分, Pro-Q Emerald 488糖蛋白和Pro-Q Diamond磷酸化蛋白荧光染料用于糖蛋白和磷酸化蛋白泳带染色, 采用高效液相色谱电喷雾电离串联质谱(HPLC-nESI-MS/MS)法鉴定蛋白. SDS-PAGE胶上的8条糖蛋白带被分别鉴定为L-氨基酸氧化酶、金属蛋白酶、谷氨酰环化酶、C-端缺失L-氨基酸氧化酶、纤溶酶原激活物、磷脂酶A2(PLA2)和神经生长因子; 5条磷酸化蛋白带被分别鉴定为Stejaggregin-A、PLA2、Crisp、金属蛋白酶 P-Ⅲ和Acutolysin e precursor, 与其它蛇毒来源蛋白具有一定的同源性. 为进一步验证方法的可靠性, 采用离子交换和凝胶过滤层析技术纯化得到了PLA2, Pro-Q Diamond染色结果显示PLA2被磷酸化. 研究所得结果为进一步研究蛋白质翻译后修饰对蛇毒蛋白的生物活性、结构与功能提供了依据.     

磷酸化蛋白质组学分析——机遇与挑战

磷酸化是生物体内存在最为广泛的一种蛋白质翻译后修饰,可以发生在约30%的蛋白质中,对各种细胞过程和生命活动如信号转导和细胞周期等起着重要的调节作用。虽然蛋白质磷酸化已经发现超过100年,但是由于其丰度低、动态分布范围宽以及生物样品的高度复杂性,对其进行大规模分离分析一直是分析化学家的一项艰巨任务。近20年来     

纳升级电喷雾离子源-四极杆-飞行时间质谱中磷酸化肽的离子抑制作用

目前磷酸化蛋白质组学研究中的主要技术是蛋白质酶解产生的磷酸化肽的质谱检测。但是实际样品中的磷酸化肽(特别是多磷酸化肽)很难被检测到。其原因普遍认为是由于质谱检测时,非磷酸化肽抑制磷酸化肽。但也有认为非磷酸化肽对磷酸化肽没有抑制作用。另外磷酸化肽之间是否存在离子抑制作用还没有报道。本文采用相同氨基酸序列的标准磷酸化肽和非磷酸化肽,将其单独和混合进行质谱检测,通过对比混合前后磷酸化肽的信号强度,证明了非磷酸化肽对磷酸化肽有离子抑制作用;单磷酸化肽对二磷酸化肽有一定的抑制作用,但不太显著;单磷酸化肽对三磷酸化肽、二磷酸化肽对三磷酸化肽均有显著的离子抑制作用。该研究为今后单磷酸化肽和多磷酸化肽的分段富集和检测提供了有力的证明。     

Profiling of Ubiquitination Modification Sites in Talin in Colorectal Carcinoma by Mass Spectrometry

Talin protein was partially purified from human colorectal carcinoma tissues, which was subject to tryptic digestion. Immunoaffinity precipitation with specific antibodies that recognize diglycyl-lysine(Lys) remnants from tryptic digestion of ubiquitinated peptides was used to enrich ubiquitinated sites in talin. Mass spectrometry coupled with capillary reverse-phase high-performance liquid chromatography was used to analyze tlie enriched peptides. Specifically, four peptides containing diglycyl-Lys remnants from talin, namely, TAK(ub)VLVEDTK, QQQYK(ub) FLPSELRDEH, K(ub)STVLQQQYNR, and EGILK(ub)TAK can be determined using mass spectrometric data. This study provides an analytical method for further study in tlie relationship between ubiquitination modification of talin and its biological activity in colorectal cancer tissues with different pathological processes.     

Down-regulation of Vinculin in Human Colorectal Carcinoma Identified by Proteomics Analysis

In the present study, we aimed to globally profile the proteins involved in colorectal carcinoma(CRC), in order to find clues to the pathological process of CRC. Pairs of malignant tissues and their adjacent healthy tissues from patients with colorectal cancer were subject to differential proteomics analysis. Two dimensional electrophoresis coupled with mass spectrometry(2-DE/MS) was used to identify differentially expressed proteins between pairs of tissue samples. A list of proteins relevant to the progression of colorectal tumor was identified by two dimensional gel electrophoresis(2-DE)-based proteomics approach. Among the identified proteins, vinculin was found to be remarkably down-regulated in colorectal carcinoma tissues. In addition, three phosphorylation modifications within the isolated vinculin were identified by in-depth liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) analysis. Our results provide a basis for further understanding the pathological significance of vinculin in the regulation of carcinogenesis, invasion and metastasis of colorectal tumors.     

Mass Spectrometric Analysis Revealing Phosphorylation Modifications of Periostin

Human periostin was over-expressed in HEK293T cells, which was enriched by nickel ion affinity resin, and further purified by gel electrophoresis. Phosphopeptides contained in the tryptic digestion of the purified periostin were enriched by TiO₂ affinity chromatography, and then analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS). LC-MS/MS analysis reveals three phosphorylation modification sites of periostin at IKVIEGpSLQPIIK(682―694), pSLHEKLKQDK(498―507) and p[TT]VLYEC^*C^*PGYM^*R(73―85). The established method could be a great help to profiling the phosphorylation status of periostin under different physiological environments, such as inflammatory and tumor micro-environments.     

Recent Progress in Mass Spectrometry-based Metabolomics for Colorectal Cancer

Metabolomics, one of the latest omics technologies, is employed to reveal overall metabolic trajectories, identify disease causative mechanisms and provide information for preventive diagnosis and drug targeting. Cancer is a disease known to alter cellular metabolism and so metabolomics can play an important role in the early diagnosis of cancer and in the evaluation of medical interventions and treatments for cancer. Many metabolomics studies rely on high-sensitive and high-throughput mass spectrometry platforms. In recent years, various mass spectrometry(MS) methodologies have been developed and enriched the scope of metabolite detection, contributing to disease studies, such as diabetes, cancer, and depression. Colorectal cancer is the third most diagnosed cancer worldwide and its incidence ranked third in China. This review focuses on the mass spectrometry technologies in metabolomics and summarizes the progress of metabolomics research in colorectal cancer.     

有机硼化合物的质谱分析

对有机硼化合物进行质谱分析,考察不同种类仪器对样品分析的影响,确定使用电喷雾质谱仪效果最好。进一步考察了流动相、正负离子检测模式、离子化试剂及其浓度等因素的影响。实验发现:样品浓度为1×10-4mol/L,使用V(甲醇):V(H2O)=1:1的混合溶剂为流动相,正离子检测,0.1mol/LNa 为离子化试剂条件下可得到满意的谱图。     

心脏胶原蛋白中交联氨基酸的质谱分析

心脏衰竭可能与心脏胶原蛋白交联异常有关,因为交联过程对心脏胶原蛋白的机械强度起决定作用.研究表明,某些交联氨基酸的含量可以用作对应胶原蛋白交联异常的分子标记,但心脏胶原蛋白交联异常的分子标记尚不清楚.本研究建立了串联质谱的分析方法可以高选择性的检测水解胶原蛋白质中两种重要的交联氨基酸-吡啶诺林(PYD)和去氧吡啶诺林(DPD).在小鼠心室胶原蛋白酸性水解产物中检测到DPD,未检测到PYD,说明PYD与心脏胶原蛋白的交联过程无关,而DPD在心脏胶原蛋白交联中起更重要的作用,有可能成为与心脏衰竭相关的分子标记.本研究提供了一种基于质谱的研究心脏胶原蛋白交联产物的方法,也可用于其它胶原蛋白的分析.     

微电纯化装置用于重组人促红细胞生成素的质谱分析前样品快速除盐

利用实验室构建的微电纯化装置(Microelectro purification device,MEPD),采用电喷雾质谱正离子模式检测,在2min之内实现重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)的在线脱盐,同时和传统的C18色谱柱(150 mm×4.6 mm...     

液相色谱能量相关二级质谱快速鉴定药物氧化降解产物

基于快速高分辨液相色谱(RRLC)的高分离能力和串联质谱技术的全扫描(TOF-MS)功能,开展了无需选择母离子可获得子离子的能量相关二级质谱(MSE)分析方法的研究.探讨了快速获取和挖掘复杂混合物中全面的组分信息,并将本方法应用于药物氧化降解产物的快速分析鉴定.对莫西沙星原料在30％H2O2中进行氧化降解,采用RRLC进行分离,分别设定高低碰撞能量的TOF-MS实验采集质谱数据,采用质量亏损过滤(MDF)进行数据处理,获取母离子与碎片离子等质谱信息,从而了解药物降解杂质的结构及相对含量.本方法为药物杂质分析和药品质量控制提供了新颖且高效的分析思路及手段.