文昌鱼酸性磷酸酶在变性剂变性时的构象及活力变…

十二烷基硫酸锂（ＬＤＳ），脲（Ｕｒｅａ）等变性剂作用于ＡＣＰａｓｅ，以荧光法跟踪该酶的构象变化，随着ＬＤＳ浓度提高荧光强度下降但发射峰没有位移，而在Ｕｒｅａ中，荧光强度随着变性剂浓度上升而下降，发射峰明显红移，由３３０－３５０ｎｍ。分别测定其变性及失活的动力学常数，比较酶构象及催化活力的关系，结果表明：变性与失活为快相和慢相的一级反应，在ＬＤＳ作用下，失活速度大于变性速度，属于快活力慢构象变化的…     

文昌鱼酸性磷酸酶在甲醇溶液中的构象与活力变化

文昌鱼酸性磷酸酶（ＡＣＰａｓｅ，Ｅ．Ｃ３．１．３．２）是一种含有铁离子的金属酶，其可见光谱中５００ｎｍ的吸收峰以及荧光５１５ｎｍ的发射峰为该酶分子含铁的特征峰，与酶活力关系密切．通过荧光发射光谱和紫外可见光谱对该酶在不同浓度甲醇溶液中的构象与活力变化进行研究．不同浓度（Ｖ／Ｖ）的甲醇对酶活力有明显的抑制作用，动力学分析表明甲醇对酶的抑制为非竞争性抑制，其抑制常数为２０％．还研究了在甲醇存在下ＡＣＰａｓｅ活力中心的构象与活力变化，结果表明其构象变化快于活力变化．     

用快速蛋白液相层析（FPLC）法纯化文昌鱼酸性磷酸酶

从厦门文昌鱼体内提纯了一种酸性磷酸酶，用快速蛋白液相层析法（ＦＰＬＣ）的Ｓｕ－ｐｅｒｏｓｅ１２柱和ＭｏｎｏＳ柱对其进一步纯化，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＦＰＬＣ的Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２柱鉴定为单一纯的酶制剂．它的分子量为５２０００，经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定该酶为二聚体．酶的提纯倍数为６１２．５２．     

用快速蛋白液相层析（FPLC）法纯化文昌鱼酸性鳞酸酶

从厦门文昌鱼体内提纯了一种酸性磷酸酶，用快速蛋白液相层析法（ＦＰＬＣ）的Ｓｕ－ｐｅｒｏｓｅ１２柱和ＭｏｎｏＳ柱对其进一步纯化，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＦＰＬＣ的Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２柱鉴定为单一纯的酶制剂，它的分子量为５２０００，经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定该酶为二聚体。酶的提纯倍数为６１２．５２。     

文昌鱼酸性磷酸酶在变性剂变性时的构象及活力变化的研究

十二烷基硫酸锂(LDS),脲(Urea)等变性剂作用于ACPase,以荧光法跟踪该酶的构象变化,随着LDS浓度提高荧光强度下降但发射峰没有位移,而在Urea中,荧光强度随着变性剂浓度上升而下降,发射峰明星红移,由330～350nm,分别测定其变性及失活的动力学常数,比较酶构象及催化活力的关系,结果表明:变性与失活为快相和慢相的一级反应,在LDS作用下,失活速度大于变性速度,属于快活力慢构象变化的模式,Urea的作用为变性速度大于失活速度,属于快构象慢活力变化的另一种模式,Urea作用后的变性酶,在测定其活力的10min内,没有观察到底物对变性酶的修复作用,以及稀释对变性酶的复活效应。     

文昌鱼酸性磷酸酯酶色氨酸残基的修饰

从厦门文昌鱼(Branchiostonia belcheri Gary)分离纯化获得聚丙烯酰胺胶电泳单一蛋白区带的酸性磷酸酯酶(EC3.1,3.2)应用化学修饰方法,荧光以及紫外-可见光谱的变化,探讨Trp残基与酶活力的关系,被NBS修饰的Trp基团仅有一个Trp残基被氧化时,酶活力丧失90％,该Trp残基为ACPase表现活力所必需,而且优先被氧化、从光谱扫描(230～600nm)结果表明,经NBS修饰以后的酶构象发生变化,文昌鱼ACPase的Trp残基和酶分子上的铁离子等基团均为酶活力的必需基团,推测两者可能以配位结合,共同维持酶活力中心的构象。     

巯基化合物和磷酸盐及其类似物对鲍鱼碱性磷酸酶的抑制作用

研究二巯基苏糖醇(DTT)、巯基乙醇(ME)等巯基化合物及磷酸盐(Na2HPO4)、砷酸盐(Na2HAsO4)、鎢酸盐(Na3WO4)和钼酸盐(Na3MoO4)对鲍鱼碱性磷酸酶(ALP)活力的影响.结果表明这些效应物对该酶都具有明显的抑制作用,而且它们的抑制作用强度依次为DTT＞ME;Na2HPO4＞Na3WO4＞Na2HAsO4＞Na3MoO4.进一步研究这些效应物对该酶的抑制作用机理,表明巯基化合(DTT、ME)均非竞争性抑制;Na2HPO4、Na2HAsO4和Na2HWO4表现为竞争性抑制;本文测定了它们的抑制常数并加于比较.     

文昌鱼早期发育中两种碱性磷酸酶的表达

以BCIP为底物研究了碱性磷酸酶在文昌鱼胚胎和幼体中的表达图式.在囊胚、原肠胚和神经胚早期(12～13小时)未检测到碱性磷酸酶的特异性表达;到神经胚中期(15小时,约6个体节),碱性磷酸酶在每一体节的中部开始表达,在胚胎中形成3～6个条纹;在18小时神经胚中,碱性磷酸酶在肌节中表达;到24小时在后部内胚层中也开始表达;在36～48小时幼体中,碱性磷酸酶在消化道中强烈表达,但在咽鳃区不表达,同时在肌节中仍有弱的表达.研究表明碱性磷酸酶可能在肌节的发育过程中具有一定作用.碱性磷酸酶在消化道中的表达可能与这一时期消化道开始行使功能有关.为了鉴定文昌鱼碱性磷酸酶的性质,还研究了L-苯丙氨酸对碱性磷酸酶表达图式的影响,结果表明文昌鱼至少存在两种碱性磷酸酶在消化道中表达的一种是肠型的,与脊椎动物碱性磷酸酶可能为同一类型;另一种主要在肌节中表达,可能是组织非特异性的碱性磷酸酶.     

低浓度镉、锌暴露对白氏文昌鱼的毒性累积及其几种重要酶活性的影响

采用亚慢性毒性实验研究了镉、锌对白氏文昌鱼(Branch iostoma belcheri)(简称文昌鱼)的毒性累积效应及体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性、磷酸酶活性及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的影响,探讨了亚致死浓度镉、锌胁迫下文昌鱼的生理生化响应.研究结果表明,镉和锌对文昌鱼的96 h半致死浓度(LG0)分别为4,60和2.26 mg/L,相比之下锌对文昌鱼的毒性更大.实验采用理论上的镊、锌安全浓度(1/10 96 h LC50)对文昌鱼进行7d的亚慢性暴露,随着暴露时间的推移,镉在文昌鱼体内呈线性增加,而锌的含量则与对照组无显著性差异,表明文昌鱼对锌的调节能力大于镉.7d亚慢性毒性实验表明文昌鱼体内的AChE活性随着金属暴露时间的延长持续下降,至第7天时镉和锌对AChE活性的抑制率分别达65％和79％;脂质过氧化产物MDA水平在金属暴露初期即达到极显著水平,随后稍有下降且镉对文昌鱼体内活性氧的诱导作用大于锌;SOD活性在暴露中期受到显著抑制,可能是由于体内过氧化程度过高抑制其活性,之后逐渐恢复.文昌鱼体内的碱性磷酸酶(AKP)活性在镉或锌暴露的第1天被显著诱导,之后恢复至对照水平;酸性磷酸酶(ACP)活性随镉暴露时间延长,呈现先升高再下降的趋势,而锌对ACP活性无显著影响.实验结果表明即使是很低浓度的镉、锌都会对文昌鱼的神经系统及抗氧化等防御系统造成一定的损伤.     

文昌鱼ALPase底物特异性及其效应物对酶活力的影响

研究了文昌鱼碱性磷酸酶的底物特异性,测定酶催化几种单核苷酸和磷酸酯化合物水解反应的Kcat/Km值,酶对单核苷酸的新和力大小依次为3’-AMP>3’-UMP>3’-CMP>3’-GMP=2’-AMP>ε-AMP>5’-CMP>5’-AMP,研究效应物对酶水解对-硝基苯磷酸的影响表明:无机磷酸盐、砷酸盐为竞争性抑制,L-?丙氨酸为反应竞争性抑制,L-半胱氨酸、二巯基苏糖醇为混合型抑制;并测定于它们的抑制常数。     

文昌鱼酸性磷酸酯酶金属辅基初探

从厦门文昌鱼Branchiostoma belcheri(Gray)分离提纯酸性磷酯酶(EC3.1,3.2),进一步经Sephadex G-75和羧甲基纤维素(CM-52)柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯酶制剂,比活力为351μm/min mg。酶液吸收峰在280nm,320nm,500nm,表现出含铁离子蛋白的特征吸收峰,用原子吸收法和化学法(邻啡绕啉比色法)分析,证明了文昌鱼酸性磷酸酯酶(ACPase)含有铁离子;还原剂Na_2S_2O_4处理浓度提高,酶活力及荧光强度下降,280nm和500nm峰下降,320nm峰消失,以Na_2S_2O_4测定ACPase失活和变性速度常激,结果表明,Na_2S_2O_4的失活常数大于变性带数。     

文昌鱼碱性磷酸酶赖氨酸基团的研究

关于文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的基本性质及功能基团等,本实验室作了系统的研究,判定1个色氨酸残基为酶活性中心所必需,赖氨酸残基(Lys)是AKP活性必需基团之一,而每分子AKP上含有36个Lys。在此基础上,采用化学修饰剂对Lys基团进行定量研究,并探讨其它功能基团的性质,为酶的结构与功能关系提供进一步的信息。     

在胍溶液中文昌鱼酸性磷酸酶活性部位的构象变化与活力变化的关系

盐酸胍中酸性磷酸酶活性部位构象变化与活力变化的关系，酶于０．６ｍｏｌ／ＬＧｕ－ＨＣｌ中，其相对活力提高２０％，当ＧＵ－ＨＣｌ浓度增加到１．２～２．４ｍｏｌ／Ｌ时，酶的相对活力，其活性部位紫外－可见光谱５００ｍｍ处吸收峰及荧光发射光谱５１５ｍｍ处的发射峰值下降，同时测定了酶的变性与失活常数，也研究了酶的重折叠与复性的关系     

文昌鱼(Branchiostoma belcheri)离体细胞原代培养初步研究

分别以不同类型的培养液和盐度条件培养文昌鱼尾部、鳃、肝盲囊组织细胞. 观察显示经培养文昌鱼三类组织块在贴壁后24 h内细胞开始从组织块内迁移出来,并迅速增殖形成细胞晕,鳃组织细胞为圆球形状,尾部组织细胞为多边形上皮样细胞,肝盲囊组织细胞为圆球形状. 其中肝盲囊细胞和鳃组织细胞在含0.45% NaCl、15%小牛血清的Eagle's MEM培养粉中生长较其他培养条件好,而尾部组织细胞则在含0.9% NaCl、15%小牛血清的Eagle's MEM培养粉中生长较其他培养条件好. 这样的细胞能存活近40天,从而为文昌鱼体外细胞培养及建细胞系提供了依据.     

凡纳对虾体内ACP、AKP酶的细胞化学定位

运用电镜酶细胞化学技术对凡纳对虾体内肝脏(L)、肌肉(M)、心脏(H)和复眼(E)等四种组织的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)进行了细胞化学定位,并与感染病毒的凡纳对虾四种组织中ACP、AKP的细胞化学定位进行比较.结果显示,在健康的对虾体内,ACP依次出现在各组织中的溶酶体、细胞核、细胞内膜、线粒体、内质网以及肝脏组织中的部分脂滴周围及微绒毛中AKP依次出现在各组织中的细胞膜、细胞核、溶酶体、内质网以及肝脏组织中的脂滴周围及微绒毛中.感染病毒后,对虾体内组织细胞出现了明显的病理变化,各组织细胞内均出现大量的髓样小体;各组织中ACP,AKP的超微细胞化学定位也发生了明显的规律性变化,表现为相应细胞器内ACP,AKP酶活性均减弱或消失,并在多数组织的细胞质中检测到ACP,AKP酶活性的高电子密度颗粒,且大量出现的髓样小体均呈阳性反应.     

毛竹茎竿纤维细胞发育过程中酸性磷酸酶的动态变化

应用磷酸铅沉淀技术对毛竹(Phyllostachys edulis(Carr.)H.De Lehaie)茎竿纤维细胞发育过程中酸性磷酸酶的动态变化进行了研究。结果表明:在纤维原始细胞形成期,酸性磷酸酶主要分布于质膜和细胞核染色质上;在初生壁形成早期,酸性磷酸酶主要分布在质膜、液泡和细胞核染色质上,并在质膜上密集分布;随着初生壁的继续形成,质膜上的酸性磷酸酶逐渐减少呈稀疏分布,而细胞核染色质上的酸性磷酸酶逐渐增多呈密集成团分布;随着次生壁的形成,染色质开始凝聚,细胞核染色质上分布的APase活性有所减弱。但随着液泡膜的裂解,在裂解的液泡膜、降解的线粒体和细胞质上具有APase活性。随着次生壁持续增厚,APase在胞间连丝、质膜、质膜内陷结构、运输小泡和凝聚并边缘化的染色质等部位持续多年保持较强的活性。因此,酸性磷酸酶可能是引起纤维细胞程序性死亡的原因之一,不同的酸性磷酸酶同功酶可能分别参与了毛竹茎秆纤维细胞初生壁和次生壁的形成,以及细胞程序性死亡过程中原生质体的降解。酸性磷酸酶持续保持较高活性与竹子纤维细胞的长寿特性也密切相关。     

杂色鲍碱性磷酸酶在DMSO溶液中的活力与构象变化的研究

以二甲亚砜（DMSO）为效应物．研究其对杂色鲍碱性磷酸酶（ALP）活力的影响，结果表明：该酶的剩余活力随着DMSO浓度增大而迅速下降，当DMSO浓度达40％，酶活力几乎完全丧失．说明DMSO对杂色鲍ALP有明显的失活作用．导致酶活力丧失50％的DMSO浓度为17％．在较低DMSO浓度（〈20％）的失活是可逆的反应过程．动力学研究表明，该酶的失活过程属于混合型．进一步测定游离酶（E）和酶底物络合物（ES）与DMSO的结合常数（K1和K1s），结果表明K1〈K1s即说明底物存在对酶被DMSO的失活作用有一定的保护作用．应用荧光发射光谱研究杂色鲍ALP经DMSO微扰后的分子构象变化情况，随着DMSO浓度增大，荧光强度逐渐增强．但发射峰未发生明显变化现象．说明酶分子中的生色基团残基的微环境发生了一定的变化．