真核生物转录的分子基础——2006年诺贝尔化学奖介绍

10月4日,瑞典皇家科学院秘书长奥奎斯特教授宣布,今年诺贝尔化学奖授予1959年诺贝尔生物或医学奖获得者ArthurKornberg之子、美国斯坦福大学化学家罗杰·科恩博格(RogerD.Kornberg),以表彰他在真核生物转录的分子基础研究中的杰出贡献。现编辑部把诺贝尔基金委员会网站上公布的、由Thelander教授撰写的获奖项目详细介绍译成中文转载,以飨读者。     

多壁碳纳米管活化A549细胞核转录子-κB的机制

探讨多壁碳纳米管对人肺上皮细胞A549核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响及其活化机制.不同浓度的多壁碳纳米管作用于A549细胞后,用活性氧(ROS)敏感探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯结合流式细胞仪检测细胞内氧化应激状态;用凝胶电泳迁移率改变这一分析技术检测A549细胞NF-κB DNA结合活性;用蛋白印迹检测A549细胞NF-κB p65蛋白和IκBα蛋白表达;用免疫荧光结合共聚焦显微镜观察A549细胞NF-κB p65蛋白的核转位情况.结果表明,多壁碳纳米管诱导A549细胞内ROS过量产生和NF-κB DNA结合活性;同时伴有p65蛋白核移位和IκBα蛋白胞浆降解.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可抑制多壁碳纳米管诱导的A549细胞内ROS产生、NF-κB DNA结合活性、p65蛋白核移位以及IκBα蛋白降解.结果表明,多壁碳纳米管可以通过诱导A549细胞氧化应激机制从而活化核转录因子NF-κB活性.     

单细胞与空间转录组分析研究进展

单细胞的异质性在胚胎发育、神经系统发育、癌症病变等生物学过程中具有重要的研究意义。单细胞转录组测序利用测序技术解析细胞内转录本序列,为细胞异质性研究提供可靠、准确的研究手段及观测视野,为揭示生物发育规律、疾病发生发展机制等提供了重要的技术手段。该文围绕单细胞与空间组学分析,综述了近年来发展的各类单细胞转录组测序、单细胞多组学测序及空间转录组分析方法,分析了其优缺点。同时展望了单细胞与空间转录组分析领域的发展趋势,即开发低成本、全方位、高通量、高分辨的单细胞空间多组学分析方法以实现对单个细胞更为细致、全面及准确的描述和精准单细胞图谱构建。     

RNA聚合酶体外转录PSTV cDNA的研究

酵母RNA聚合酶Ⅱ虽能在体外忠实转录PSTV,但不能转录相应的cDNA。大肠杆菌RNA聚合酶不仅能转录PSTV,还可转录其cDNA。根据对转录产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Southern分子杂交以及非转录反应的排除实验确证:大肠杆菌RNA聚合酶转录PSTV cDNA 属于忠实性转录。本文首次提出 PSTVcDNA可以构成一个转录单位,其中含有能指导特异性转录起始的启动子区。证明此启动子区在Avall酶切后的132bp小片断上,很可能在5′端BamHl切点附近。     

分子动力学研究亚铁血红素激活蛋白转录激活机理

以3种亚铁血红素激活蛋白(Heme activator protein, HAP)-DNA 复合物(野生型HAP1-wt, Ser63/Arg63突变HAP1-18 和 Ser63/Gly63突变HAP1-PC7)为对象对亚铁血红素激活蛋白的转录激活机理进行了分子动力学研究. 对3个复合物分子动力学轨迹的比较性分析显示, 涉及到上游活化序列(Upstream activation sequences, UAS)识别的蛋白质-DNA 相互作用分布与实验观测到的3种蛋白转录活性一致. 进一步对3个复合物进行柔性分析显示, 3个DNA分子具有相似的柔性, 而又有所不同, 特别在涉及UAS识别的N-端和Zn2Cys6结构域前部有明显的柔性差异. 蛋白质柔性的差别导致不同的蛋白质-DNA相互作用. 因此亚铁血红素激活蛋白的N-端和Zn2Cys6结构域前部的柔性大小能够调节亚铁血红素激活蛋白转录激活功能.     

酵母RNA聚合酶Ⅱ体外转录系统的研究

利用酵母核抽提物研究了酵母ADH1和PHO5基因的体外转录反应。以特异的RNA探针检测,首次得到了PHO5和ADH1基因启动子的体外转录产物。体外转录反应被低浓度的α-鹅膏蕈碱所抑制。PHO5基因可以在体外与体内一致或接近的位点正确起始。体外转录反应与模板的量在一定范围内呈线性关系。缺失酵母启动子的模板不能给出转录产物。     

苜蓿根瘤发育阶段豆血红蛋白基因的转录和转译作用

从第2—10星期的苜蓿根瘤中分离的豆血红蛋白mRNA进行体外转译,都表现有转译活性,产生豆血红蛋白的各个组份,并各自维持在一个相对恒定的水平上,说明豆血红蛋白的基因,一旦表达,在根瘤的整个生命期间就不在转录水平上调节。与第4星期壮年的苜蓿根瘤豆血红蛋白mRNA体外转译系统试验相比,在第10星期老龄根瘤的豆血红蛋白mRNA体外转译系统中加入苜蓿豆血红蛋白组份,转译抑制作用降低,加入肌红蛋白、牛血红蛋白,转译未受到促进,说明这时的豆血红蛋白合成在转译水平上的调节作用降低。     

特异切割点突变癌基因转录物的核酶设计与克隆

按“锤头结构”模型设计、合成,并筛选到了针对活化癌基因T24-ras第十二位密码子G→T点突变的核酶克隆。在镁离子存在条件下,该核酶能选择定点切割T24-ras转录物而对正常C-Ha-ras转录物不起任何破坏作用;在接近生理环境及C-Ha-ras与T24-ras mRNA同时存在条件下,该核酶仍能有效选择性切割突变基因产物。这为利用核酶技术治疗因基因突变引起的机体病变提供了现实的可能性。     

甜菜黄脉坏死病毒RNA3和RNA4有生物活性体外转录产物及功能研究

甜菜黄脉坏死病毒RNA3和RNA4全长cDNA的合成是分别以Oligo-d(T)_(15)为引物合成第一链cDNA,cDNA的第二链的合成则分别应用RNA3和RNA4特异引物完成。全长双链cDNA分别克隆在pGEM3Zf(+)载体中,置于噬菌体Sp6启动子控制下。在体外以质粒DNA为模板应用“run off”系统及Sp6RNA Polymerase成功地合成了大量的具有高度生物活性的转录产物RNA3和RNA4。在两种转录反应系统中,以第一种方法即转录与加帽(capping)分步进行转录效率高,第二种方法(转录与加帽同时进行)转录效率较低,但转录产物侵染性更高。虽然在RNA3和RNA4转录产物的5′末端和3′末端分别含数目不同的非病毒核酸序列,但转录产物的活性并未受到显著的影响。应用这种具有高度生物活性的体外转录产物与该病毒Rg1分离物机械接种甜菜幼苗根毛,首次阐明了RNA3是导致甜菜丛根病的主要因素。     

腺病毒(adenovirus)DNA的转录活性与宿主细胞核骨架(nuclear matrix)的关系

本文用温和的选择性细胞抽提技术,提取腺病毒(adenovirus)感染6h的Hela细胞核内各种DNA组分,分别以腺病毒DNA的早期转录区(El_a,El_b)与晚期转录区(L_2)作探针进行Southern杂交,结果表明只有正在活跃转录着的腺病毒DNA片段才与宿主细胞核骨架紧密结合,从而说明宿主细胞核骨架可能对病毒DNA的转录有重要作用。     

光谱解析法在天然产物结构阐明工作中的应用——钩吻素子(Koumine)结构的阐明

<正> 钩吻素子(A)是从草药钩吻(又名断肠草,大茶叶Gelsemium elegans benth)中分离出来的。该化合物是50年前(1931)由前上海药物研究所赵承嘏所长分离出来,并定出了分子式C_(20)H_(22)N_2O,但当时对该化合物的结构式一无所知,60年代初我们在中国科学院上海有机化学研究所开始测定其结构,限于当时的条件,仅利用红外,紫外光谱和一些化学方法测出了它的发色基团(芳香环系统)和功能团。     

基于报告基因技术的MDR1转录抑制剂高通量筛选模型的建立和应用

MDR1基因是引起肿瘤多药耐药的主要基因,其编码的P-gp蛋白可持续将药物由胞内排出胞外以降低胞内药物浓度导致多药耐药,MDR1基因的转录抑制剂可抑制MDR1基因在癌细胞中的表达,从而逆转肿瘤多药耐药.通过克隆MDR1基因的启动子,将其插入pGL3-basic质粒构建MDR1-luc＋报告基因载体,再将重组载体转染入HepG2肝癌细胞并筛选单克隆细胞株,构建了MDR1启动子的高通量筛选模型,Z′因子为0.75;通过对中药样品库的筛选,得到两种中药提取物高良姜水提物、红豆蔻醇提物有明显耐药逆转效果,EC50值分别为高良姜水提物16.37mgL-1和红豆蔻醇提物14.96mgL-1,RT-PCR验证上述两种阳性样品具有明显的抑制MDR1基因表达的作用.以上结果为MDR1基因的转录抑制剂高通量筛选奠定了基础.     

形貌转录法制备Ag-P(AM-co-MAA)复合微球

以反相悬浮聚合技术合成的丙烯酰胺(AM)和甲基丙烯酸(MAA)共聚高分子微凝胶P(AM-co-MAA)为模板,结合反胶束法制备得到Ag3PO4-P(AM-co-MAA)复合微球,并将其分散于乙醇溶剂中通过化学还原Ag3PO4-P(AM-co-MAA)复合微球制备得到粒径为几十微米,具有表面图案,且结构为核-壳型的Ag-P(AM-co-MAA)复合微球材料.能量散射X射线(EDX)谱表明壳化学组成以金属银为主,核以高分子模板为主;扫描电子显微镜(SEM)观察结果表明银-高分子复合微球的表面形貌与其前驱体类似,且可以通过选择模板、改变模板组成、调整金属难溶银盐沉积量等因素加以调控;X射线衍射(XRD)分析表明前驱体复合微球表面Ag3PO4全部转化为单质银.生物抗菌实验表明该类微球材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有较强的抑制作用.     

环境内分泌干扰物对雌激素受体表达与转录激活的调控效应及分析技术

环境内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals, EDCs)种类繁多,来源复杂,环境污染普遍,对野生动物与人类造成了不同程度的暴露。EDCs可通过调控机体内分泌系统,干扰心血管、生殖、神经等多个系统的正常功能,从而引起机体代谢综合征、肥胖症、神经毒性、生殖发育毒性和癌症等的发生发展。污染物调控雌激素受体(Estrogen receptors, ERs)产生内分泌干扰效应是当前EDCs研究的主要方向。本文围绕ERs的基本生理特征、ERs表达与转录激活的分析检测技术,及EDCs调控不同组织来源ERs的生物学意义进行系统综述,以期从ERs激动/拮抗效应的角度,为新型化学品的内分泌干扰效应筛选及分子机制解析提供科学思路。     

肿瘤抑制因子WT1对人的诱导型一氧化氮合成酶基因的转录调节作用

将人的诱导型一氧化氮合成酶(hiNOS)启动子构建在带荧光素酶基因的载体pGL3-basic上, 构建成用荧光素酶为系统的启动子, 以研究载体p8.3iNOS. 结果显示, 肾母细胞肿瘤抑制因子(WT1)能够有效地抑制hiNOS启动子的转录; 且WT1的4个选择性剪接本的抑制效果有所不同, 其中WT1(-/-)在两种肝癌细胞(HepG2和Hep3B)中对hiNOS的表达均具有最强的抑制作用, 并且抑制效果具有剂量依赖性, 用Western blot检测结果进一步证实HepG2细胞中WT1(-/-)过量表达能下调hiNOS表达. 以上结果说明WT1在肝癌细胞中对人的hiNOS具有转录调节作用.     

硫酸铈铵对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响及转录差异研究

利用血球计数法测定藻密度,研究不同浓度硫酸铈铵诱导子对三角褐指藻细胞生长的影响。采用高效液相色谱(HPLC)测定经不同浓度诱导子处理后三角褐指藻岩藻黄素的含量。通过荧光定量PCR研究岩藻黄素生物合成途径中相关基因转录差异,并利用SAS9.0统计软件对荧光定量PCR结果做主成分分析。结果显示:在一定浓度范围内硫酸铈铵(0.2~1.6 mg·L-1)抑制三角褐指藻细胞的生长。HPLC结果表明:随着硫酸铈铵浓度的增加,岩藻黄素含量呈先上升后下降的趋势,当硫酸铈铵浓度为0.2 mg·L-1时,岩藻黄素含量最高,达1.28 mg·g-1DW,比对照组提高了60%。定量PCR分析结果表明,硫酸铈铵浓度在0.2 mg·L-1时,岩藻黄素生物合成相关基因玉米黄素环氧酶基因(zep)、八氢番茄红素合成酶基因(pys)、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(zds)、番茄红素β-环化酶基因(lcyb)、胡萝卜素异构酶基因(rtiso)和八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)转录水平与对照组相比极显著提高(P<0.01),与岩藻黄素含量变化相一致。主成分分析(PCA)结果表明:这些基因与岩藻黄素生物合成显著相关,其中,lcyb基因和pds基因对岩藻黄素生物合成贡献率最大。     

致癌机理的阐明和高选择性抗癌剂的合成

1979年, 戴乾圜提出的化学致癌机理的双区理论发现: 环境致癌剂均代谢成特定的双官能烷化剂, 并通过诱发DNA互补碱基交联而启动癌变. 戴乾圜当时解释互补碱基交联启动细胞癌变的根源时指出: DNA即基因的突变主要都是由缺乏互补模板的交联的互补碱对所诱发(易于依靠互补模板修复的单个碱基损伤只有远为次要的作用), 而突变的基因借逆转录机制经历潜伏期而引起细胞的深度突变即奇异染色体的产生和细胞的最后癌变. 致癌剂的致突变谱、癌细胞中奇异染色体的结构、逆转录机制在正常细胞中的广泛存在和致癌剂均能诱发DNA股间交联等, 都从实验上证明了双区理论所揭示的上述致癌过程的分子机理. 传统的抗癌剂都是基因毒性的, 即抗癌剂均具有强力的致癌、致畸胎、致不育和致突变的潜力. 作者首次将致癌剂的抗癌药效和基因毒性的差别, 定义为抗癌剂的选择性. 作者发现可以突破抗癌剂的随机筛选和偶然发现的方式, 借双区理论按照理论预想设计高选择性抗癌剂. 实践证明: 抗癌烷化剂本身或代谢后都是双官能烷化剂. 戴乾圜将双官能抗癌烷化剂在DNA碱基之间的交联, 划分为易于修复的股内或股间非互补碱基间的、不具致癌性的良性交联, 和难于修复的互补碱基间的、表现致癌性的恶性交联. 因此双区理论设计高选择性抗癌剂的理论观点认为: 应力求抑制恶性交联而强化良性交联. 在双区理论指导下合成了总称为双区铂系列的铂络合物, 其中一系列顺式二取代苯甲胺合二卤合铂(II)进行了细胞和动物药效学实验. 当时已知的主导性抗癌剂顺铂是癌细胞灭杀率和动物疗效最高的抗癌剂. 但若干双区铂对各种癌细胞的灭杀率均超过了顺铂, 文中援引的四个双区铂系各对小鼠肉瘤S₁₈₀的抑瘤率和小鼠白血病L₁₂₁₀的延寿率均分别超过顺铂, 而其毒性均远较顺铂为低. 毒性远低于顺铂而实验动物疗效超过顺铂的药物, 至今尚未见有其他实例. 根据双区理论和群论的预想设计, 对碳铂(卡铂)作了增加一个CH₂的最小结构修饰, 合成了新化合物顺式-二氨合环戊烷-1,1-二羧酸根合铂(II), 命名为铭铂. 铭铂的水溶性较碳铂高一倍, 油溶性远高于碳铂, 动物急性毒性较碳铂低一倍, 对快速生长的腹水型动物瘤株的疗效, 显著性地高于碳铂. 双区理论预想设计的铭铂的低基因毒性得到了实验的证明, 铭铂以对TA 102株回复突变度量的基因毒性较顺铂低200倍, 较碳铂低10倍, 对所有受试妊褥母鼠的子代均没有致畸胎作用. 铭铂用于临床以后, 世界上第一个按照预想合成的高选择性抗癌剂将在癌化疗上显示何等的效果, 则将拭目以待. 此外, 借双区理论解释了近来抗癌铂络合物的若干经验性研究, 并试行从选择性的角度予以评介.     

经分子设计改造的酵母转录活化因子Ac─［Q~（236），Q~（242）］GCN4（226—252）—GGC—NH_2的化学合成及二聚化

经分子设计改造的酵母转录活化因子Ａｃ─［Ｑ~（２３６），Ｑ~（２４２）］ＧＣＮ４（２２６—２５２）—ＧＧＣ—ＮＨ_２的化学合成及二聚化张若衡，王鹤，徐筱杰，唐有棋（北京大学物理化学研究所，北京，１００８７１）关键词酵母转录活化因子，固相肽合成，空气氧化...