DNA羟甲基化测序技术

5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)是继5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)之后发现的第六种碱基, 已在多种哺乳动物组织和细胞中检出. 与5mC相比, 5hmC的含量更低, 但5hmC也具有非常重要的生物学功能. 已有的研究表明, 5hmC参与了染色体重新编程、基因表达的转录调控, 并在DNA去甲基化过程中发挥重要作用. 另外, 5hmC可能与特定肿瘤的发生密切相关, 有可能成为肿瘤早期诊断的生物标志物. 因此, 发展可靠、灵敏和准确的5hmC检测技术至关重要. 本综述针对DNA羟甲基化的检测及测序技术进行了简要介绍.     

DNA中醛基嘧啶的化学检测

基因组DNA除A、G、T、C四大经典碱基外,还存在上百种稀有碱基。其中,醛基嘧啶(5-醛基胞嘧啶和5-醛基尿嘧啶)是DNA中天然存在的嘧啶类修饰碱基,在哺乳动物细胞中广泛分布。5-醛基胞嘧啶除参与DNA主动去甲基化过程外,还具备独立的表观遗传功能;而5-醛基尿嘧啶通常被认为是一种基因毒性很高的DNA氧化损伤。根据醛基嘧啶的特征结构,有针对性地开发准确、灵敏和简便的检测方法,从全基因组范围内对他们进行定性、定量和区域定位,是进一步明确这类碱基修饰物调控机制的基础和前提。本文从选择性化学标记的角度总结了近年来醛基嘧啶检测方法的研究进展。     

电化学免疫传感器检测TET1蛋白

基于Ten-eleven translocation 1(TET1)蛋白催化5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine,5mC)生成5-羟甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine,5hmC),结合5hmC抗体的免疫识别反应,建立了一种电化学分析方法用于TET1蛋白的特异性检测.以金纳米颗粒(Au...     

老鼠Tet1蛋白能氧化单链脱氧核糖核酸上的5-甲基胞嘧啶到5-羟甲基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶(英文)

5-甲基胞嘧啶在哺乳动物细胞中具有广泛的作用.而它被双脱氧家族Tet蛋白氧化所得的产物5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶也被证明在细胞发育和5-甲基胞嘧啶动态平衡调控中具有关键的作用.已有的研究结果表明,Tet蛋白能够识别双链DNA上的5-甲基胞嘧啶,并将其氧化成5-羟甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶.我们通过质谱仪检测发现,老鼠Tet1蛋白的DNA结合结构域还能识别和氧化单链DNA上的5-甲基胞嘧啶.这一发现暗示我们,Tet蛋白家族不但具有已经发现的氧化双链DNA上5-甲基胞嘧啶的功能,还有可能作用于DNA的复制及转录,甚至具有氧化单链RNA上对应的甲基修饰碱基的能力.     

DNA甲基化修饰的定位分析方法研究进展

5?甲基胞嘧啶(5?Methylcytosine,5mC)作为DNA中研究最为广泛的表观遗传修饰,不改变基因的序列,但是可以调控基因表达,从而在生命体的生长、发育和疾病发生中发挥着重要作用.研究5mC的分布、变化及作用机制有助于加强对生命体活动本质的理解.阐明基因组DNA中5mC修饰的生物学功能主要依赖于精准破译其在基...     

DNA甲基化-非甲基化碱基间堆积作用的理论研究

运用二级Mфller-Plesset(MP2)理论方法和cc-pVDZ基组优化了6-甲基鸟嘌呤(O6-MethylG),4-甲基胸腺嘧啶(O4-MethylT)以及5-甲基胞嘧啶(C5-MethylC)与DNA碱基鸟嘌呤(G),腺嘌呤(A),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)之间的堆积构型.在MP2/aug-cc-pVXZ//MP2/cc-pVDZ(X=D,T)水平上,采用完全基组外推方法校正了堆积碱基对间的相互作用能,并用完全均衡校正法(CP)校正了基组重叠误差(BSSE).MP2计算结果表明,DNA碱基甲基化使得嘧啶-嘧啶、嘧啶-嘌呤堆积碱基间的平行旋转角发生明显改变,并使堆积碱基间的相互作用能增大.在MP2/cc-pVDZ计算级别上得到了各堆积碱基对的全电子波函数,并用分子中的原子理论(AIM)分析了堆积碱基对间的弱相互作用.AIM分析结果显示,甲基化增强了堆积碱基间的π-π作用,且甲基氢与相邻碱基间形成H2CH…X(X=O,N,CH3,NH2)等类型的氢键.甲基化损伤使碱基间重叠程度增大、π-π作用增强以及堆积碱基间形成多个氢键,是堆积作用能增加的主要原因.     

RNA表观遗传修饰及其纳米检测探针研究进展

核酸是生物体内最重要的生物分子之一,是遗传的重要物质基础.作为遗传物质,核酸通过脱氧核糖核苷酸d A、d T、d G、d C及相应的核糖核苷酸A、G、C、U之间千变万化的排列组合来编码遗传信息.除了这些常规的核苷酸外,核酸中还存在很多修饰的核苷酸结构,这在RNA中尤为明显.在众多的核酸修饰中,那些可逆的,并且可遗传的修饰,即表观遗传学修饰,在近年来受到更多关注,这是由于它们与基因表达调控、疾病发生、生长发育等重要的生命过程息息相关.RNA表观遗传修饰目前主要是指N6-甲基腺嘌呤,这是RNA中相对含量最高的修饰类型.最近几年,其生物功能研究领域中涌现出了大量激动人心的成果.此外,RNA中存在的假尿嘧啶核苷,最近也被提出具有表观遗传方面的功能.本文主要针对这两种RNA的表观遗传修饰及其相关生物功能展开讨论,总结这个热门命题的最新研究进展.同时,对于具有重要生物功能的RNA表观遗传修饰的检测研究也非常重要,其与功能研究能够相互辅助,因此本文也将讨论在检测方面的新方法,主要考虑纳米材料在该方面的应用.     

基于超分子化学的核酸表观遗传修饰研究

核酸是生物体的遗传物质,在生命体系中发挥着重要作用.除了构成核酸的经典碱基之外,核酸中还存在天然修饰的碱基,这被称为核酸的表观遗传修饰.核酸的表观遗传修饰在基因表达过程中具有重要的调控作用,对生物体遗传和生命生长过程影响很大,并且核酸表观遗传与疾病密切相关.超分子化学是研究分子间键的化学,而许多生物分子都需要通过超分子化学作用来发挥其生物功能,可以说生物体内天然存在着大量的超分子化学过程.本文综合评述了基于超分子化学的核酸表观遗传修饰研究的一些代表性工作.     

B掺杂SWCNT表面吸附DNA碱基的理论研究

采用基于密度泛函理论的LDA (PWC)方法对比研究了纯单壁纳米碳管(SWCNT)和B掺杂单壁碳纳米管(B doped SWCNT)表面吸附DNA碱基(腺嘌呤)A、(胸腺嘧啶)T、(胞嘧啶)C、(鸟嘌呤)G的吸附特性和本质, 计算研究了最佳吸附位点, 吸附能, 以及稳定吸附模型的电子结构. 结果表明掺杂元素B的引入不会造成SWCNT的结构畸变, 可以局部影响碳纳米管的电子结构, 有效增强SWCNT与DNA碱基之间的电子相互作用, DNA碱基以化学吸附的形式修饰在B掺杂SWCNT的表面. 研究结果预示B掺杂SWCNT表面修饰DNA碱基有潜力成为DNA生物传感器生物识别界面的主要成分.     

基于荧光小分子2-氨基-7-甲基-1,8-萘啶对C碱基的识别检测DNA双链中的C/C错配

单碱基错配是单核苷酸多态性(SNPs)的一种,是导致突变的DNA损伤类型之一.单碱基错配的检测对于从分子水平上阐明多种疾病形成的原因,实现基因水平的治疗都是至关重要的前提条件.发展具有高灵敏度、高选择性的单碱基错配检测方法势在必行.常用的单碱基错配检测方法包括凝胶电泳、荧光检测、SPR和质谱检测等.本文采用2-氨基-7-甲基-1,8-萘啶(AMND)作为荧光探针,AMND能嵌入双链DNA(ds-DNA)中的错配位点,并通过氢键识别错配碱基,这一结合过程伴随探针小分子的荧光淬灭,通过检测荧光淬灭现象实现单碱基错配及错配碱基类型的识别,建立了SNPs荧光分型方法.     

单壁碳纳米管和室温离子液体胶修饰电极

短单壁碳纳米管(S-SWNTs)与疏水性室温离子液体(RTIL)1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)以质量比1:1研成胶, 修饰在玻碳电极(GCE)上制备S-SWNT&;RTIL/GCE. 以铁氰化钾、抗坏血酸(AA)和亚甲基蓝(MB)为电化学探针, 用伏安法表征. 结果表明, 该修饰电极具有优异的电催化性能和富集效应. 以B-R缓冲溶液为支持电解液, 单链鲱鱼精脱氧核糖核酸(ssDNA)在S-SWNT&;RTIL/GCE上具有灵敏的伏安响应, 于0.532和0.808 V处分别出现鸟嘌呤碱基和腺嘌呤碱基的氧化峰. 鸟嘌呤碱基和腺嘌呤碱基在S-SWNT&;RTIL/GCE上的电极反应标准速率常数k’s分别为1.84×10^-2和3.69×10^-2 s-1. 在最佳条件下, 应用微分脉冲伏安法检测, 鸟嘌呤碱基的氧化峰电流与ssDNA 的浓度在40 μg·L-1-5.0 mg·L-1 范围内呈现良好的线性关系, 检测限为5 μg·L-1 (S/N=3, 信噪比).     

荧光小分子2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶识别dsDNA中胞嘧啶凸出

双链DNA（dsDNA）中单碱基凸出结构（bulge structure）具有重要生物学意义,这种结构也是DNA靶向药物的目标部位之一.荧光小分子2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶（ATMND）能够通过氢键识别胞嘧啶（cytosine）,因而对dsDNA中凸出的胞嘧啶表现出明显的特异性结合.与其余三种凸出的碱基相比,ATMND与凸出部位胞嘧啶的结合伴随着ATMND荧光的明显猝灭,因而可以用于胞嘧啶凸出结构的识别.利用解旋温度测量、荧光、圆二色光谱对ATMND和存在胞嘧啶凸出结构的dsDNA相互作用进行了研究.荧光滴定结果表明ATMND和dsDNA中凸出部位未配对的胞嘧啶的结合常数K11=4.8×105M？1.通过对含胞嘧啶凸出结构的dsDNA与ATMND结合前后的解旋温度曲线进行解析,发现胞嘧啶凸出结构相邻碱基对凸出的胞嘧啶与ATMND的结合有较大的影响.荧光测量结果也表明ATMND荧光的猝灭效率与凸出结构相邻碱基的类型有关,当相邻碱基为鸟嘌呤（guanine,G）时,荧光猝灭效率最高.基于dsDNA中凸出的碱基对ATMND荧光猝灭效率存在明显差异这一现象,设计了探针DNA实现了乳腺癌相关基因（PGR gene rs3740753）中单核苷酸多态性（G/C变异）的荧光分型.     

基于高区别因子自组装三臂DNA纳米探针检测人体多重耐药基因

建立了一种新的基于高区别因子三臂DNA纳米探针的荧光分析法检测人体多重耐药(MDR)基因。此探针由保护链P1和互补链C1与信号报告部分(信号链S1和信号链S2)组成:P1与修饰了荧光猝灭基团Dabcyl的S1及C1部分碱基杂交;修饰了荧光基团FAM的S2与C1另一部分碱基杂交。探针内部Dabcyl和FAM相互靠近,荧光猝灭。当MDR基因存在时,其与三臂DNA纳米探针发生链替代反应,释放荧光信号。在最优条件下,单碱基错配产生的微小的热力学改变即可影响该探针链替代效率,从而实现高特异性检测MDR基因和其点突变基因(2m、3m、3d、5m、5d)。该探针对不同突变位点及同一突变位点的不同突变类型MDR基因均展现出良好的特异性,其检测3d的区别因子达到24.1,平均区别因子达到11.8。在混合人血清中,MDR基因的回收率为99.0%~101.7%。此外,本方法通用性好,不需要重新设计S1和S2即可实现对miR-21的特异性检测。     

液相色谱-串联质谱分析组织中基因组脱氧核糖核酸羟甲基胞嘧啶水平

5-羟甲基胞嘧啶通过阻止脱氧核糖核酸(DNA)甲基化转移酶1(DMNT1)甲基化胞嘧啶来影响DNA甲基化的程度。本文建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定组织中全基因组5-羟甲基胞嘧啶水平的方法。采用苯酚-氯仿提取组织DNA,提取的DNA用88%甲酸在140 ℃下裂解,DNA裂解液加入同位素胞嘧啶作内标,经N2吹干后,加乙腈-水(9:1, v/v)溶解,用LC-MS/MS检测5-羟甲基胞嘧啶的含量,并计算全基因组中5-羟甲基胞嘧啶的水平。结果表明,5-羟甲基胞嘧啶的线性范围为0.1～30 ng/mL,相关系数为0.9969,检出限(信噪比为3计)和定量限(信噪比为10计)分别为0.057 ng/mL和0.090 ng/mL;日内相对标准偏差和日间相对标准偏差分别为5.13%和6.24%;加标回收率为90.24%～97.53%。用该方法检测了大鼠大脑组织DNA羟甲基化水平,平均结果为0.66%。该方法简便,重现性好,灵敏度较高,能满足全基因组5-羟甲基胞嘧啶定量检测的要求。     

Aerolysin蛋白纳米孔道直接检测单个DNA碱基修饰

基于Aerolysin生物膜通道蛋白的纳米孔道电化学分析技术,因其高的电化学空间限域能力可实现超灵敏DNA单分子检测。本文利用单个Aerolysin纳米孔道在无需标记、无需扩增的条件下直接分辨3种具有单个碱基差异的单链DNA。实验结果显示,具有单个炔基侧链基团修饰的单个ss DNA在限域空间内与Aerol-ysin纳米孔道的相互作用时间较未修饰的ss DNA增长近7倍,电流阻断程度增大7%,且高斯峰半峰宽减小了44%,增强了Aerolysin纳米孔道对单个DNA分子的分辨能力。研究成果有望推动Aerolysin纳米孔在DNA直接测序及表观遗传修饰检测中的应用。     

DNA修饰碱基5-甲基胞嘧啶和8-羟基鸟嘌呤的毛细管气相色谱分析及质谱鉴定

探索了GC/FID定量分析DNA修饰碱基 5 甲基胞嘧啶和 8 羟基鸟嘌呤的实验条件 ,用GC/MS鉴定各有关成分。结果表明 ,DNA水解物中不同成分可被成功地衍生和分离 ;5 甲基胞嘧啶和 8 羟基鸟嘌呤的相对摩尔反应因子分别为 3 0和 1 3;灵敏度分别为 5 50× 1 0 9mV·s/ g和 7 59× 1 0 1 0 mV·s/ g ;检测限可分别达 36 4pg/s和 1 5 8pg/s ;整个分析流程的相对标准偏差小于 2 0 %。     

掺铂／聚3-甲基噻吩修饰电极研究氨酪酸对大鼠脑纹状体中单胺类神经递质影响

氨酪酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质.本研究探讨了外源性GABA对单胺类神经递质及其代谢产物的影响.研制了一种新型掺铂/聚3-甲基噻吩玻碳修饰电极,利用原子力显微镜(AFM)对该电极进行了表征,通过循环伏安法(CV)和微分脉冲伏安法(DPV)研究了单胺类神经递质及其代谢产物在该修饰电极上的电化学行为,结果表明:该修饰电极对单胺类神经递质及其代谢产物有显著的催化作用,电极的灵敏度高,稳定性和重现性好.在液相色谱电化学检测实验中,去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、5-羟色胺(5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)在修饰电极上的电流响应灵敏.5种被测物的检测线性范围宽达3个数量级以上,检出限分别为2.0×10-10 mol/L(NE)、1.0×10-10 mol/L(DA)、3.0×10-10 mol/L(DOPAC)、4.0×10-10 mol/L(5-HT)和7.0×10-10 mol/L(5-HIAA).将该方法与微渗析活体取样技术联用,研究了GABA对大鼠脑纹状体中单胺类神经递质及其代谢产物的影响.     

DNA修饰碱基5-甲基胞嘧啶和8-羟基鸟嘌呤的毛细管气相色谱分析及质谱鉴定

 探索了GC/FID定量分析DNA修饰碱基 5 甲基胞嘧啶和 8 羟基鸟嘌呤的实验条件 ,用GC/MS鉴定各有关成分。结果表明 ,DNA水解物中不同成分可被成功地衍生和分离 ;5 甲基胞嘧啶和 8 羟基鸟嘌呤的相对摩尔反应因子分别为 3 0和 1 3;灵敏度分别为 5 50× 1 0 9mV·s/ g和 7 59× 1 0 1 0 mV·s/ g ;检测限可分别达 36 4pg/s和 1 5 8pg/s ;整个分析流程的相对标准偏差小于 2 0 %。     

基于锁核酸的高选择性新型分子信标

通过在分子信标的错配位点修饰锁核酸, 不仅可有效地改善其单碱基错配识别能力, 还可提高检测灵敏度. 因而有望发展成为一种通用的提高分子信标单碱基错配识别能力的方法.     

化学干预N6-甲基腺嘌呤修饰的研究进展

信使RNA(Messenger RNA, mRNA)上存在众多修饰,包括N⁶-甲基腺嘌呤修饰(N⁶-methyladenosine, m⁶A)、N¹-甲基腺嘌呤修饰(N¹-methyladenosine, m¹A)及胞嘧啶甲基化(5-methylcytosine, m⁵C)等.其中, m⁶A是mRNA内部修饰碱基中占比最高的一种,影响着mRNA的5′和3′端加工、在细胞中的定位、降解和翻译等过程,并在转录后调控基因表达水平,以此参与胞内的多种生理活动.本文综合评述了m⁶A修饰的分子机制及其与多种疾病的关系,概述了m⁶A鉴定技术的发展历程,重点讨论了m⁶A化学干预的最新研究进展,以期让读者全面了解m⁶A修饰,并为后续开发针对m⁶A修饰的小分子药物提供参考.