人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向成软骨样细胞的定向诱导分化

从人骨髓中分离和培养间充质干细胞(MSCs),在原代和传代培养中其形态学上均为贴壁、纤维状的细胞,随着代次的增加细胞形态更加趋于一致.流式细胞仪鉴定CD45、CD34、CD117、HLA-DR阴性,CD29、CD166阳性,并随着培养代次的增加,阳性比率和阴性比率出现相应的上升和降低,说明细胞中MSCs纯度增加.第三代细胞大约有80%处于G0/G1期,S+G2+M期约20%,说明MSCs有强大的增殖潜能.在传代培养中的最适接种密度为5 000个/cm2左右.MSCs在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期3个时期,传代培养的MSCs生长速度比原代的MSCs明显快很多.采用程序降温法对MSCs进行冻存,60～90 d后对冻存的MSCs进行复苏,发现MSCs仍可在体外良好生长4～6代,特定的MSCs样本可以扩增10代,说明经过冻存的细胞仍具有良好的增殖能力.对4例标本的前三代MSCs在体外利用TGF-β1和维生素C诱导两周后,用RT-PCR证明MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原的mRNA,说明培养的细胞具有向成软骨样细胞分化的潜能,由此进一步证实其为MSCs.     

骨髓间充质干细胞与造血干细胞共培养对脐血造血干细胞扩增的作用

脐带血造血干细胞的异体移植对高剂量化疗的患者恢复造血功能是一种有效的细胞学疗法，脐带血造血干细胞的体外扩增能提高有效植入的造血干／祖细胞的数量，将扩增10d造血干／祖细胞移植给高剂量化疗的成人患者，患者平均约在移植后的第26天（第15－45天）达到了嗜中性粒细胞的植入，为了加快有核细胞数量的扩增和嗜中性粒细胞的成熟，在以骨髓间充质干细胞的培养基质细胞层，采取阶段扩增方法培养单个核细胞和分选的CD34^ 细胞，并与无骨髓间充质干细胞的培养体系进行对照，从冻存的脐带血中分离的单个核细胞和CD34^＋细胞分别在含有骨髓间充质干细胞的100mL培养袋中用50mL ADM培养液培养7d,7d后收获细胞并移入含有1L ADM培养液的1L培养袋中继续培养7d，每天计数细胞量，14d后收获细胞，并进行相应的细胞分析，扩增的结果表明，在有骨髓间充质干细胞的共培养体系中，单个核细胞培养的有机细胞扩增了346倍，CD34^ 细胞培养的有核细胞扩增了674倍，无骨髓间充质干细胞的非共培养体系中，两者分别扩增了152倍和377倍，两种培养体系都获得了定向祖细胞（GM－CFC）和原始祖细胞（HPP－CFC）的扩增，有骨髓间充质干细胞的共培养体系获得了更多的嗜中性粒细胞。     

PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管与骨髓间充质干细胞亲和性研究

采用全骨髓分离法分离并纯化获得了大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs),将复合材料PRGD/PDL-LA/β-TCP/NGF(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子)与大鼠骨髓间充质干细胞复合培养之后进行扫描电镜样品制备及观察,对其细胞亲和性进行评价.结果表明,PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合材料与大鼠骨髓间充质干细胞具有良好的细胞亲和性.骨髓间充质干细胞在复合材料表面铺展良好,多数细胞呈现梭形,接近原代培养状态.     

人原始生殖细胞的分离和体外培养

从4～10周龄药物流产胚胎的生殖嵴和肠系膜组织中分离原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),培养在添加人重组白血病抑制因子(rh LIF)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(rh bFGF)和Forskolin的小鼠饲养层细胞上.经过4～7 d培养,PGCs形成典型的鸟巢状集落.集落在传代过程中保持碱性磷酸酶活性,且胚胎阶段性特异抗原1(SSEA-1)、胚胎阶段性特异抗原3(SSEA-3)免疫荧光染色呈阳性.具有分化潜能的PGCs能在体外连续传代培养12代.结果表明从药物流产胚胎中分离的人类PGCs可以在体外培养成为具有分化潜能的多能性干细胞.     

脐带血造血干/祖细胞体外扩增制剂及其临床前安全性检测分析

造血干细胞移植（HSCT）可用来治疗多种恶性造血系统疾病．HSCT成功植入的先决条件之一是必须输入足够量的造血干／祖细胞（HS／PCs）．细胞剂量过少会导致植入时间延长,移植失败的可能性增大．从脐带血中直接分离的造血干细胞因数量较少而不能满足临床移植的需要．利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合（SCF＋G-CSF＋TPO）使脐血造血干／祖细胞体外扩增75．2±15．0倍,CD34^＋细胞扩增33．4±12．3倍．将扩增的细胞收集,重新悬浮于L-15培养液中制成造血干／祖细胞制剂,并在建立相应的检测技术基础上,进行了细胞制剂的无菌检测以及细胞制剂中细菌内毒素、牛血清残留量和干细胞因子残留量的检测．通过上述检测分析,为扩增的造血干／祖细胞制剂服务临床需要,辅助治疗恶性血液病和再生障碍性贫血以及遗传性贫血重建造血功能提供实验依据．     

脐血贴壁细胞饲养层支持造血干/祖细胞扩增的初步研究

探讨来自脐血的贴壁细胞的特征及其对脐血造血干/祖细胞体外扩增的支持作用.利用流式细胞术对脐血中培养出的贴壁细胞进行了鉴定,同时观察其形态学特征,并由此建立细胞饲养层;在饲养层基础上建立共培养体系,分别体外扩增单个核细胞和CD34+细胞,观察饲养层对体外扩增的影响,并检测扩增后细胞的GEMM-CFC形成潜能.结果表明,脐血贴壁细胞呈纤维状,其CD14阳性细胞仅3.8%,而CD13、CD166、CD29阳性细胞分别为51.8%、35.6%、16.5%;与仅用外源细胞因子的非共培养体系相比,用饲养层加外源细胞因子建立的共培养体系中的单个核细胞和CD34+细胞扩增效率分别提高了2.09倍和2.94倍,并且前者扩增出的细胞比后者具有更高的GEMM-CFC形成潜能.可初步推定,从脐血中培养出的纤维状贴壁细胞具有骨髓间充质干细胞的特性.在适当的条件下,可以形成饲养层细胞,为造血干/祖细胞体外扩增提供支持基质细胞.
     

银鲳脾脏和肾脏组织细胞体外培养研究

为探究银鲳脾脏和肾脏组织细胞体外培养条件, 本研究采用组织块培养法对银鲳脾脏和肾脏组织进行原代培养. 实验选用DMEM/F-12、M199和DMEM等作为基础培养基, 在其中分别添加体积分数为10％、15％、20％的胎牛血清, 并添加青链霉素及庆大霉素以防细菌污染. 结果表明: 银鲳脾脏和肾脏组织在胎牛血清体积分数为20％的DMEM/F-12培养基中贴壁最好, 迁出细胞的种类最多, 细胞生长速度最快. 其中脾脏组织共迁出6种不同的细胞, 分别为: 免疫细胞、基质细胞、上皮样细胞、成纤维样细胞、造血灶和未知细胞; 肾脏组织共迁出3种细胞, 分别为: 上皮样细胞、巨噬细胞和成纤维样细胞.     

体外分阶段共培养法扩增的脐血造血干/祖细胞移植于NOD/SCID小鼠的实验研究

研究用分阶段共培养法进行体外扩增的脐血造血干/祖细胞对NOD/SCID小鼠重建造血功能的作用,探讨新扩增技术体系对将来临床移植的可行性.分离脐血单个核细胞,分别用rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF组合(非共培养组合)和rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF+人骨髓间充质干细胞组合(共培养组合)进行脐血造血干/祖细胞的体外扩增,并对扩增细胞进行流式细胞术和细胞集落形成能力分析.在移植实验中,将经致死剂量射线照射后的NOD/SCID小鼠随机分为3组,每组10只.A组:每只移植8.5×106个用rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF+人骨髓间充质干细胞组合扩增的细胞;B组:每只移植8.5×106个用rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF组合扩增的细胞;C组:每只仅输注0.5 mL生理盐水.移植后定期眼眶底部采血,分析重建造血.12周后取存活小鼠骨髓,检测人特异Alu基因的存在率.实验结果表明,rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF+人骨髓间充质干细胞组合的共培养法显著提高了造血干/祖细胞的扩增倍数,并且有利于造血干/祖细胞的自我更新和提高细胞集落形成能力.两种组合扩增的细胞移植小鼠12 d后,小鼠的白细胞类群开始回升,25 d后基本恢复到了基数水平.在45～55 d后小鼠细胞有明显的第2个恢复期,并且共培养组合扩增细胞移植的小鼠中第2次恢复明显快于非共培养组合.12周后在两种组合移植的小鼠中检测到人特异Alu序列片段的概率分别为87.5%(7/8)和88.9%(8/9).由此可推论,分阶段共培养扩增体系有效地提高了脐血造血干/祖细胞的扩增能力和重建造血能力.     

超声和磁共振成像在胎盘植入产前诊断应用的系统评价

为评价超声(Ultrasound, US)和磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)在胎盘植入(Placenta Accreta, PA)产前诊断上的应用价值, 就近年来US和MRI在PA产前诊断的研究进展进行了综述, 并展望了该领域未来的研究方向. 首先, 总结分析了PA在US成像和MRI中的表现, 且对两者的诊断性能进行了比较, 得出两者在诊断的准确性上无显著差异, US成像仍是主要的筛查工具, MRI作为辅助手段在识别PA的形貌和深度以及描述胎盘后壁方面具有较大优势; 然后, 提出了目前PA产前诊断所面临的挑战, 对新研究方向及发展趋势进行了展望, 分析了机器学习结合影像组学在PA产前诊断上的应用, 认为该应用具有重大意义, 可使诊断结果更加准确, 同时可为临床医生进行多学科管理和早期制定方案提供更有价值的参考.     

高效建立129S1/SvImJ 小鼠胚胎干细胞方法的探讨

选取超排后129S1/SvImJ品系小鼠的优质囊胚,使用辐照后冻存复苏的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,对比高浓度酶短时间消化法和低浓度酶长时间消化法,以0.25%胰酶-0.04%EDTA高浓度酶短时间消化法高效建立了4株小鼠胚胎干细胞系,建系率为36.31%.碱性磷酸酶,核型分析,体外分化和体内分化能力以及小鼠胚胎干细胞表面特异性分子标志0ct-4和Nanog的检测等表明,4个ES细胞系均为典型的小鼠胚胎干细胞系.所建立的ES细胞系为大规模培养ES细胞,进行后续的实验建立了理想的材料平台.     

大麦花药培养及其胚性悬浮细胞系的高频快速建立

研究了（1）在低温预处理过程中，不同相对湿度对大麦花药出愈率的影响；（2）低温处理愈伤组织对植株分化的影响；（3）高频快速建立大麦胚性悬浮细胞系，结果表明，低温预处理的较大相对湿度能明显促进花药的出愈率，低温处理愈伤组织能提高绿苗率，以7周龄的花药胚性愈伤组织为起始材料高频快速建立了均质，分散性好的胚性悬浮细胞系，建立频率约为25%～50%，已8～9周龄的花药胚性愈伤组织作为起始材料，难以建立胚性悬浮细胞系。