天花粉胰蛋白酶抑制剂及其类似物的全合成

天花粉胰蛋白酶抑制剂(Trichosanthes trypsin inhibitor, TTI)是一含27个氨基酸残基的多肽,其中包括三对硫硫键。本文报道了它的化学全合成及其分子内二硫键重组,合成产物纯化后其氨基酸序列以及与胰蛋白酶的抑制当量比均与天然抑制剂相一致。并合成了此抑制剂的类似物,其N端第6位Met残基由Ala所取代,合成产物纯化后,其抑制活力也与天然抑制剂相同。此结果为今后天花粉胰蛋白酶抑制剂作为融合蛋白用基因工程表达以及产物的后处理提供了依据。     

慈菇蛋白酶抑制剂的抑制特性及其活性中心的探讨

本文采用亲和层析分离纯化了结晶慈菇蛋白酶抑制剂A和B,抑制剂A和B均为双头多功能蛋白酶抑制剂,抑制剂A能同时等当量抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,对激肽释放酶的抑制作用较弱,抑制剂B能当量抑制2克分子的胰蛋白酶,对激肽释放酶的抑制活力高于抑制剂A,但对胰凝乳蛋白酶的抑制作用远比抑制剂A弱。化学修饰以及胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶对抑制剂A的竞争性结合表明:抑制剂A和B的两个活性中心均为Lys和Arg残基,其中Lys活性中心专一抑制胰蛋白酶,而由Arg活性中心构成的活性区域则表现为多功能,能抑制多种蛋白酶,从抑制剂A和B的结构特征推测,两活性中心应分别为Lys-Ser(44—45)及Arg-Tyr-Lys(76—78),在抑制剂A中还存在一疏水性残基参与对胰凝乳蛋白酶的抑制,此残基位于由Arg活性中心所构成的活性区域中。     

综合大学应用化学类专业发展迅速

北京大学物理化学研究所结构他学实验室最近用分子置换法成功地解得了3(?)分辨率绿豆胰蛋白酶抑制剂Lys活力碎片(含有35个氨基酸残基)—牛胰蛋白酶(含有223个氨基酸残基)复合物的晶体结构及4(?)分辨率的绿豆胰蛋酶抑制剂(含有72个氨基酸残基)—猪胰蛋白酶(含有223个氨基酸残基)的四方晶系复合物的晶体结构,并得到了以上两个复合物的初步结构模型。复合物中的绿豆抑制剂属于Bowman-Birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂,这类抑制剂的空间结构在国内外尚未有过报导,这项工作在国际上第一次揭示了Bowman-Birk型抑制剂的空间结构。这种类型的抑     

天花粉蛋白一级结构的修正及不同产地天花粉蛋白的研究

胰蛋白酶酶解天花粉蛋白, 用高效液相色谱分离酶解肽段, 用顺序仪测定其有关肽段的顺序。用羧肽酶A, B, Y测定了天花粉蛋白C-端和天花粉蛋白溴化氰降解肽CB1的C-端顺序, 修正了我们1985年测定的天花粉蛋白一级结构, 证明天花粉蛋白由246(7)氨基酸残基所组成, 除C-端微观不均一外, 与Collins结果一致。同时比较了芜湖产天花粉蛋白一级结构与平湖产的天花粉蛋白一级结构, 没有发现两者的一级结构有差别。     

Urokinase片断的二级、三级结构预测及构效关系研究

urokinase(简称UK)属于絲氨酸蛋白酶,其一级结构已经测定。去掉前135个残基后得到的低分子量UK(LUK)氨基酸残基的顺序与糜胰蛋白酶、胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶十分类似。从二硫桥的配置来看LUK与糜胰蛋白酶比较接近,而UK对Lys侧链处肽键的专一性则和胰蛋白酶相近。在这一类酶中,起到活性中心作用的氨基酸为Ser195,His57及Asp102.在UK中此三个氨基酸都保留了下来。蛋白水解酶中起专一性作用的残基主要是     

基于精氨酸酶切的蛋白质C端肽段富集方法的优化及评估北大核心CSCD

基于聚合物的蛋白质C端反向富集策略是用于研究蛋白质C端最为广泛的策略之一。目前,基于胰蛋白酶(trypsin)切割精氨酸残基C端(ArgC型酶切)的蛋白C端组学方法对蛋白质C端的鉴定深度仍有待提高。为解决这一问题,该研究对此方法进行了优化和评估:建立了基于“V型”过滤装置的“一锅法”富集流程,避免了副反应的干扰,缩短了样本的制备时间;优化了蛋白水平乙酰化反应条件,最大限度地降低了丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基上的副反应,提高了肽段鉴定的可信性;优化了基于固相萃取枪头膜片过滤柱(StageTip柱)的样品分离过程,使C端肽段的鉴定深度增加至原来的4倍。通过以上优化,按照肽段水平错误发现率(FDR)<0.01、离子分数(ion score)≥20,且C端带有乙醇胺修饰的数据筛选标准,从人HEK 293T细胞中共鉴定出696个蛋白质C端。若仅要求肽段水平FDR<0.01,鉴定数目进一步增加到933个,这是基于聚合物富集策略的蛋白质C端组学方法所得的最大数据集之一。探索了胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)切割精氨酸残基N端(ArgN型酶切)与不同肽段N端衍生化修饰组合对蛋白质C端鉴定数目和种类的影响,“LysargiNase酶切+肽段N端乙酰化”新策略在原有“胰蛋白酶酶切+肽段N端二甲基化”策略的基础上将鉴定蛋白质C端的种类提升了47%。综上,该研究通过对基于Arg型酶切的蛋白C端组学方法的优化,提升了C端肽段的鉴定深度,扩大了C端肽段鉴定的覆盖范围。该方法将有望成为系统性表征蛋白质C端的有力工具。     

栝楼蛋白 2: 栝楼蛋白部分化学结构的初步测定

栝楼蛋白(Trichobitacin)是从栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim, Cucurbitaceae)中新发现的核糖体失活蛋白, 分子量为27,228; pI为9.6。应用基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和快原子轰击质谱法(FAB-MS)分别测定胰蛋白酶酶解栝楼蛋白和天花粉蛋白(Trichosanthin)的混合肽质谱, 通过比较发现了一些分子量相同的肽。由于这两种蛋白质都来源于栝楼块根, 同源性比较强, 所以这些肽序列在两种蛋白质中基本一样; 再结合蛋白N-端自动顺序仪测定栝楼蛋白N-端的结果, 确定了栝楼蛋白N-端38个氨基酸的顺序, 栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解后所得肽段用HPLC分离纯化, 再用蛋白质自动顺序仪, DABITC/PITC双偶合手工法和质谱法共确定了栝楼蛋白N-端, C-端等100多个氨基酸残基的序列。     

栝楼蛋白 2: 栝楼蛋白部分化学结构的初步测定

栝楼蛋白(Trichobitacin)是从栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim, Cucurbitaceae)中新发现的核糖体失活蛋白, 分子量为27,228; pI为9.6。应用基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和快原子轰击质谱法(FAB-MS)分别测定胰蛋白酶酶解栝楼蛋白和天花粉蛋白(Trichosanthin)的混合肽质谱, 通过比较发现了一些分子量相同的肽。由于这两种蛋白质都来源于栝楼块根, 同源性比较强, 所以这些肽序列在两种蛋白质中基本一样; 再结合蛋白N-端自动顺序仪测定栝楼蛋白N-端的结果, 确定了栝楼蛋白N-端38个氨基酸的顺序, 栝楼蛋白经胰蛋白酶酶解后所得肽段用HPLC分离纯化, 再用蛋白质自动顺序仪, DABITC/PITC双偶合手工法和质谱法共确定了栝楼蛋白N-端, C-端等100多个氨基酸残基的序列。     

意蜂工蜂酸性磷酸酶的化学修饰及荧光光谱

本文对意蜂工蜂酸性磷酸酶(ACPase，E．C．3．1．3．2)在分离纯化的基础上，研究化学修饰剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、二巯基苏糖醇(DTT)、对氯汞苯甲酸(pCMB)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、溴代乙酸(BrAc)在不同浓度，不同时间条件下对酶活力及荧光光谱的影响。结果表明：半胱氨酸残基的巯基和二硫键被修饰后，酶活力下降且荧光强度减少；色氨酸残基被修饰后酶活力降低，荧光强度减小；含羟基的氨基酸残基被修饰后酶活力降低，荧光强度增加；组氨酸残基被修饰后酶活力基本不变，酶的荧光强度也不改变。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究——Lys活性碎片的还原及重氧化

本文证明绿豆胰蛋白酶抑制剂Lys活性碎片由 A_1,A_2两条肽链通过两对二硫键联结而成,今通过DTT还原及凝胶过滤可将A_1(26个氨基酸残基),A_2(9个氨基酸残基)两肽链拆分.还原型的A_1肽链重氧化后活力的回收率是原有活性碎片总活力的25%.经固相胰蛋白酶亲和层析纯化的A_1活性碎片以单体和二聚体两种分子形式存在,两者可在Sephadex G-25柱上分开,以单体为主,二聚体活性较低.此结果进一步证实,绿豆胰蛋白酶抑制剂的分子进化过程是由一原始单头抑制剂通过基因重复及基因突变演化而来。此外比较了Lys活性碎片和重氧化肽链A_1的CD图谱。     

人纤维蛋白溶酶原中色氨酸残基的化学修饰

以Ｎ－溴代琥珀酰亚胺为修饰剂，对人纤维蛋白溶酶原（ＨＰｇ）中色氨酸（Ｔｒｐ）残基的分布及其与酶活力的关系进行了研究，发现每个ＨＰｇ分子有１９个Ｔｒｐ残基，５个位于分子表面：有２个是快反应残基，其中１个是活性必需的氨基酸，酶被修饰后其荧光光谱及圆二色谱发生了变化。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂片段及其类似物的合成

绿豆胰蛋白酶抑制剂的Lys活性碎片由两条分别含有26及9个氯基酸残基的多肽链通过两对分子间二硫键连接而成。用DTT还原能拆分两链,其中长链含6个半胱氨酸,在空气中氧化后能恢复25％原Lys碎片活力。本文报道了此长链的化学合成和二硫键重组。合成产物的氯基酸组成与文献报道的一致。但活性明显低于天然产物。为此对绿豆抑制剂的部分序列重新进行测定,结果表明原P_2′位的Lys应为Ile按新测定序列,从长链26肽的N端和C端各去掉两个残基合成一个22肽,此22肽的活性与天然的26肽相当。此外还合成了此22肽的类似物,其活性中心的Lys残基由Ala取代,产物对胰蛋白酶和弹性蛋白酶都无抑制活力。     

聚半乳糖醛酸酶（PG2）中色氨酸残基的化学修饰

用化学修饰法以Ｎ－溴代琥珀酰亚胺作修饰剂，对聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ２）中色氨酸（Ｔｒｐ）残基与酶活性的关系进行研究，发现１个ＰＧ２分子中有６个Ｔｒｐ残基，其中４个位于酶分子内部，２个位于酶分子表面，该发现通过表面荧光猝灭实验得到进一步证明，酶分子表面的２个Ｔｒｐ残基中，有１个为活性必需的氨基酸，它的修饰导致大部分酶活力丧失，底物保护实验进一步证明该活性必需的Ｔｒｐ可能位于酶的活性部位，酶被修饰后其圆     

化学修饰法表征Bacillus smithii T7产耐热菊粉酶催化活性中心的必需氨基酸残基

采用化学修饰法研究了史氏芽胞杆菌Bacillus smithiiT7产耐热菊粉酶活性中心氨基酸残基,发现该酶活性中心存在一个组氨酸残基和一个谷氨酸(或天冬氨酸)残基.修饰前后的酶动力学参数变化表明组氨酸残基参与了底物的结合和催化过程,而谷氨酸(或天冬氨酸)的羧基亲核攻击促使底物分解.邹氏作图法证明酶活性中心存在两个必需的色氨酸残基,荧光和圆二色光谱研究表明色氨酸残基在酶的催化和酶的耐热性方面起重要作用.     

计算机辅助的羧肽酶法测定多肽羧端顺序

在初步用计算机辅助的羧肽酶法测定了天花粉蛋白C-端顺序的基础上, 进一步设计了两个计算机程序-DPS程序和CPA程序. 用合成小肽和天然的肽对这两个计算机程序进行模型实验证明, 运用这两个程序能分别满意地从羧肽酶的酶解动力学曲线中获得重要的C-端顺序信息, 并测定了天花粉蛋白分子中未知肽段CB-3的C-端顺序为: -SerAlaSerAlaLeuHserOH, 这一顺序后来已经其他实验结果所证实. 本法不仅使C-端顺序测定延长至七个氨基酸, 而且还基本上解决了多肽或蛋白质含有多种多次重复氨基酸残基的C-端顺序测定.     

聚酰胺-胺树状大分子修饰硅胶固定化胰蛋白酶的研究

以聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子修饰的硅胶为载体,胰蛋白酶为模型,考察了PAMAM的代数和固定化条件对酶的固载量及活力的影响.实验结果表明:选用3.0代PAMAM树状大分子修饰硅胶为载体固定化胰蛋白酶,酶促反应最适pH值为9.0,最适温度为60℃,对酪蛋白表现米氏常数K<,m>为7.76mg/mL,固定化胰蛋白酶表...     

规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象

对蛋白质样品制备中引入的氨基酸残基的一种现象--蛋白质酶切肽段氨基端的环化修饰现象的初步研究结果显示,很多以谷氨酰胺(Q)或氨乙酰化修饰的半胱氨酸(CAM_C)残基起始的肽段会发生氨基端的环化修饰,且修饰反应不完全,在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在,并且环化修饰后的肽段的反相色谱保留时间发生延迟.在数据库检索时添加环化修饰,可以提高蛋白质的鉴定成功率.本研究结果为大规模的蛋白质质谱数据解析提供了有价值的参考.     

鸡肝果糖-6-磷酸-2-激酶的巯基与碱性氨基酸残基的研究

本文报道半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸等残基在鸡肝果糖-6-磷酸-2-激酶的作用。DTNB修饰的结果表明鸡肝PFK-2每亚基具有9个巯基。其中,在中性pH下可滴定的巯基数目为6个;在Fru6P存在下的可滴定巯基数为4个;而在ATP存在下的可滴定巯基数为7个。在修饰的过程中酶的活力随着被滴定的巯基数目的增加先是提高后为下降,但最后的酶仍不低于初始活力。NEMI对该酶活力的影响与DTNB的相似,它的修饰首先使酶活力升高,当巯基完全被修饰后的活力仍不低于初始活力。但是PCMB和碘代乙酸对该酶的活力影响很小。pH动力学结果显示该酶有1个pK~a为9.0的必需基团,它很可能是赖氨酸残基。PLP和苯乙二醛修饰PFK-2皆可导致该酶的失活。Fru6P对PLP的作用有强烈的保护,Fru2,6P2和Pi也有一定的保护作用,而ATP则稍有增加PLP对该酶的失活作用;苯乙二醛修饰的结果和PLP不同,Fru2,6P2有较强的保护作用,ATP有部分保护作用,Fru6P则对失活完全无保护作用。以上结果表明赖氨酸残基是鸡肝PFK-2与底物Fru2,6P2结合有关的必需残基,而精氨酸可能是该酶与产物Fru2,6P2结合有关的残基。     

天花粉蛋白1.73分辨率结构测定及其精化

本文报道了用面探测器收集一套1.73分辨率天花粉蛋白(TCS)正交晶体的X射线衍射数据,利用已知的α苦瓜子蛋白模型,取10—4范围的TCS强度数据,应用分子置换法测定了晶体结构,并且采用限制参数最小二乘法在10—1.73分辨率范围内修正模型结构。修正结果,晶体学R因子为0.186,键长标准偏差为0.013,键角标准偏差为2.48°,一个不对称单位中找到133个水分子。本文详细描述了天花粉蛋白分子的结构、温度因子、氢键、结合水、保守残基的分布以及分子间相互作用。保守残基14Tyr的羟基与157位的羰基氧形成的氢键,对维持活性部位构象有重要作用;保守残基160Glu和它在活性部位的构象对酶的催化活性起着关键性作用。     

天花粉蛋白C-端顺序的测定

采用肼解法、乙内酰硫脲法和羧肽酶法检测了天花粉蛋白的C-端氨基酸有二,分别为Met和Ala借计算机辅助的羧肽酶法, 测定了天花粉蛋白C-端顺序, 其结果显示C-端是非均一的, 有两个未端, 分别为-ArgAsnAsnMetOH和-ArgAsnAsnMetAlaOH.这些结论已经从天花粉蛋白的溴化氰降解物中获得游离的Ala, 和从该蛋白的胰蛋白酶酶解物中分离得与该两顺序相符的两个碎片而完全证实.