基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微

在传统共聚焦显微技术的基础上,图像扫描显微技术使用面阵探测器来代替单点探测器,结合虚拟数字针孔并利用像素重定位和解卷积图像重构算法将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍,实现了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐点扫描的方式,三维成像速度相对较慢,限制了其在活体样品成像中的应用.为了进一步提高图像扫描显微术的成像速度,本文提出了一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微成像方法和系统.在照明光路中,利用高速数字微镜器件产生周期分布的聚焦点阵对样品进行并行激发和快速二维扫描;在探测光路中,利用双螺旋相位片将激发点荧光信号的强度分布转换为双螺旋的形式;最终,利用后期数字重聚焦处理,从单次样品扫描数据中重构出多个样品层的超分辨宽场图像.在此基础上,利用搭建的系统分别对纤维状肌动蛋白和海拉细胞线粒体进行成像实验,证明了该方法的超分辨能力和快速三维成像能力.     

基于共焦照明的合成孔径成像方法

合成孔径成像技术利用虚拟大尺寸孔径可实现局部被遮挡目标的有效探测,但是当场景中存在强背向散射时,重聚焦图像质量大大降低。针对上述问题,提出了一种基于共焦照明的合成孔径成像方法。该方法根据场景目标分布的深度信息对照明光源进行调制,有效实现聚焦面目标和非聚焦面目标接收的光照度差异;同时结合合成孔径成像重聚焦方法,实现了局部被遮挡的共焦照明面目标的高质量重建。利用反镜阵列搭建了共焦照明合成孔径成像系统,对指定深度目标进行共焦照明重聚焦成像,结果表明,所提方法能够有效区分场景中聚焦面和非聚焦面目标反射光的强度,并能获取共焦照明面目标的高质量图像信息,效果远远优于现有的合成孔径成像方法。     

基于波前相位调制的宽视场光片显微镜研究

为解决光片显微镜成像视场范围小的问题,通过光束波前相位调制与图像拼接技术实现了光片显微镜对样本的宽视场成像。数值模拟了照明光束在波前相位调制后物镜聚焦面处的光强分布。搭建了光片显微镜光路系统,并对荧光微球、菊花花粉进行成像实验。采用片状照明光束对不同聚焦位置处的样本进行成像,再将图像进行剪裁、拼接得到宽视场成像结果。实验结果表明,488nm激发光通过数值孔径为0.3的物镜照明样本成像,可在保持光片厚度为0.81μm的情况下达到31.93μm的成像视场,视场扩展到原视场的3倍以上。仿真和实验表明,采用光束波前相位调制与图像拼接技术可在不损失层切能力的前提下扩展光片显微镜的成像视场。     

一种实现共焦显微镜空间微分成像的新方法

提出了一种实现共焦显微镜空间微分成像的新方法。为了获得空间微分图像,首先利用时间分辨技术结合互补调制技术,获得两束相位相反的调制光,然后利用这两束相位相反的调制光结合共焦扫描技术,实现共焦显微镜的空间微分成像。实验表明:这种空间微分技术可以准确实现共焦显微镜的空间微分成像,从而获得成像物体的边缘轮廓和实现边缘增强。     

基于同步辐射的快速扫描X射线微束荧光成像方法

在上海光源硬X射线微聚焦光束线站(BL15U1)上, 基于EPICS软件平台, 集成运动控制, 光强探测, 荧光探测等功能, 实现了"飞行"模式 (on-the-fly) X射线扫描微束荧光成像方法. 用"飞行"扫描X射线荧光成像法获得了标准镍网, 以及微量元素Cu, Zn,K, Fe在样品老鼠脾内的分布图像, 结果显示该方法不但在速度上有了极大的提高, 而且获得的元素分布图像具有高质量. 关键词： 快速扫描X射线微束荧光成像 同步辐射 微量元素分布     

激光扫描实时共聚焦显微成像系统设计

共聚焦扫描显微镜已成为生物医学和材料科学领域研究中非常有价值的一种工具.本文给出了一种反射型激光扫描共聚焦显微成像系统的系统结构和具体设计.采用多面体转镜进行水平扫描,摆镜进行垂直扫描.利用商品透镜设计了光学扫描中继系统,采用光电倍增管作为激发出的荧光探测器,同时给出了数据采集和扫描同步控制系统的组成与设计.利用CODE V优化光学扫描系统以获得尽可能小的扫描光斑尺寸和较大的视场,并综合考虑了采样频率、扫描速度和探测器对整个系统性能的影响,从而给出了该型共聚焦显微成像系统的相互匹配的设计参量.分析结果表明:共聚焦扫描系统设计合理可行|从光学扫描系统到PMT探测单元的各项技术指标得到优化,满足实时探测的要求|该系统具有适应性强,易升级,低成本的技术特点,同时可达到同类商品的技术性能.     

小鼠卵母细胞染色体三维双光子荧光图像的轴向衰减

双光子荧光显微镜作为一种高分辨光学仪器,已经被广泛应用于生物样品的非侵入式三维光学成像中。相比共聚焦显微镜,双光子荧光显微镜拥有更深的探测深度。然而,即便如此,在对较厚的生物样品进行非侵入式光学三维成像时,样品的成像质量也往往会随着探测深度的增加而下降。在临床和生物学领域对研究母性遗传起重要作用的小鼠卵母细胞拥有较大的直径(80～100 μm),吸收和散射效应较为明显。本文研究小鼠卵母细胞染色体的三维双光子荧光图像随探测深度增加图像质量的衰减程度。通过对所得图像进行轴向衰减矫正,利用体积作为参数,将矫正前后小鼠卵母细胞内染色体三维双光子荧光图像进行对比。结果表明,由于吸收和散射效应,卵母细胞存在较严重的光学轴向衰减问题,因此,对用双光子荧光三维成像手段获得的小鼠卵母细胞图像进行衰减矫正是有必要的。这为进一步精确定量的研究卵母细胞内染色体的三维构像打下良好的基础。     

电光调制在被动综合孔径成像探测中的应用

介绍了一种新型被动综合孔径成像探测方法:视场辐射信号被接收和放大后,通过电光幅度调制将其幅度和相位信息加载到光波上,经光纤传输在末端形成阵列,通过光学系统直接成像,将视场实时恢复出来.该方法可实现工作在微波、毫米波和太赫兹波段的高分辨力实时成像探测的目的.深入分析了电光调制器在综合孔径成像探测中的应用,建立电光调制模型,讨论了在小信号调制下的电光幅度调制近似理论.通过数值计算与仿真分析,得到综合孔径成像探测中电光调制器的调制信号强度限制的有关结论.结果表明,利用上变频电光调制技术和光信息处理,所得到的成像仿真图的半峰全宽和信噪比性能都优于传统的基于下变频技术的成像仿真结果.     

激光扫描共聚焦显微镜中云纹法的实验研究

将激光扫描共聚焦显微镜与实验力学中的云纹法相结合,提出了激光扫描共聚焦显微镜云纹法并对其进行了实验研究.实验中以激光扫描共聚焦显微镜的扫描线作为虚拟参考栅,以1 200 lines/mm的全息光栅作为试件栅,这两组栅线相干涉形成云纹条纹.对激光扫描共聚焦显微镜中云纹的形成原理和出现条件进行了讨论,对实验结果与理论分析进行了比较.结果表明,激光扫描共聚焦显微镜云纹法是真实可行的.由于该方法无需干涉系统且对测量环境无特殊要求,因此有望在待测物体表面微米量级变形观察和测量上得到应用.     

基于点扫描的超分辨显微成像进展

光学显微镜一直推动着现代科学技术的发展.随着科学的进步,对显微成像分辨率的要求在生物、材料等领域日渐凸显,而常规宽场显微成像一直面临着成像分辨率衍射受限的问题.1968年出现的共聚焦显微镜作为点扫描显微镜的开端第一次实现了远场下成像分辨率的突破,它具有层切性好、信噪比高等优点.在1994年出现的受激辐射荧光损耗显微镜将显微成像能力突破到2.8 nm左右,并成为目前效果最佳、应用较广泛的超分辨显微技术.荧光差分显微和饱和荧光吸收竞争等点扫描技术具有无荧光染剂限制、饱和光强低、光路简单等优势,并且能取得1/6波长的分辨能力,进而在超分辨显微领域仍有着发挥空间.Airyscan技术作为以上方法的补充可以弥补点扫描系统中由于探测小孔半径减小而带来的信号丢失,从而提高成像信噪比和分辨率,但阵列探测器成本较高.上述点扫描显微镜通过改变照明或者探测的方式实现了分辨率突破.本文详细讨论了点扫描超分辨方法的原理、成像效果及面临的瓶颈,并分析了点扫描超分辨显微镜在应用和技术上的趋势.     

平场复用多焦点结构光照明超分辨显微成像

多焦点结构光照明显微技术(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50μm的成像深度内和1Hz的成像速度下实现两倍于衍射极限分辨率的提升,相比传统的宽场结构光照明显微技术,具有较大的成像深度和层析能力,更适合应用于厚样品的长时程三维超分辨成像.然而, MSIM存在成像速度慢、图像处理过程复杂等问题.本文提出了一种基于平场复用多焦点结构光照明的快速超分辨显微成像方法和系统(flat-field multiplexed MSIM, FM-MSIM),通过在照明光路中插入光束整形器件,将高斯光束转变为均为分布的平顶光束,提高激发点阵的强度均匀性和扩大视场;通过将每个衍射受限的激发点沿y方向延长,形成新的多路复用多焦点阵照明图案,提高能量利用率,减少扫描步数,进而提高成像速度和信噪比;结合基于多重测量矢量模型的稀疏贝叶斯学习图像重构算法,简化图像重构步骤,在保证空间分辨率的同时实现至少4倍于传统MSIM的成像速度.在此基础上,利用搭建的FM-MSIM系统进行了BSC细胞微管样片和小鼠肾切片标准样片的超分辨成像实验,实验结果证明...     

基于最大似然法的共焦拉曼光谱成像方法

随着现代科技对纳米微观区域兴趣的增加,如DNA测序、分子纳米器件微结构检测等,其对拉曼光谱技术的空间分辨力提出了更高的要求,而现有共焦拉曼光谱技术受自身原理限制,空间分辨力已无法满足科学需求。针对这一问题,在现有共焦拉曼光谱技术的基础上,提出一种基于最大似然算法的共焦拉曼光谱成像方法。该方法将超分辨图像复原技术与共焦拉曼光谱技术相结合,利用基于Poisson-Markov约束的最大似然超分辨复原算法对共焦拉曼光谱图像进行超分辨图像复原处理,恢复图像高频成分,进而改善共焦拉曼光谱系统的空间分辨能力,实现超分辨成像。仿真分析和实验结果表明,提出的基于最大似然算法的共焦拉曼光谱成像方法在不改变现有共焦拉曼光谱系统光学结构的前提下,仅对单幅拉曼光谱图像进行超分辨图像复原处理,即可将系统空间分辨力提高到200 nm,实现超分辨成像,同时该方法具有较强的噪声抑制能力。该方法有效地提高了共焦拉曼光谱系统的空间分辨力,为物理化学、材料科学等前沿领域中的高空间分辨微区光谱探测提供了一种新的途径,是一种行之有效的高空间分辨的共焦拉曼光谱成像方法。     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

Transport-based image reconstruction in turbid media with small source-detector separations

We demonstrate a new method for imaging through several millimeters of a turbid sample with a resolution of approximately 100 mum by combining aspects of confocal reflectance microscopy and diffuse optical tomography. By laterally displacing the pinhole aperture of a confocal microscope we can achieve small source-detector separations and detect minimally scattered light. A reconstruction algorithm based on the first Born approximation to the radiative transport equation is then used to reconstruct an image of a 100-mum absorbing object located 2 mm beneath the surface.     

Transillumination spatially modulated illumination microscopy

The diagnostic utility of a conventional transillumination microscope, the most common imaging modality in clinical use today, is limited by the microscope's resolution. It is, however, possible to achieve lateral resolution well beyond the classical limit by using laterally structured illumination in a wide-field, nonconfocal microscope. In this method, the spatially modulated illumination (SMI) makes high-resolution information that is normally inaccessible visible in the observed image. Previously presented SMI microscopy systems operated in epifluorescence mode. We describe the design, construction, and testing of a novel transillumination SMI microscope. As transillumination is necessary for most medical applications, such as histopathologic evaluation of biopsy tissue and chromosomal analysis, such a system should have a significant diagnostic effect.     

Single-exposure optical sectioning by color structured illumination microscopy

Structured illumination microscopy (SIM) is a wide-field technique that rivals confocal microscopy in optical sectioning ability at a small fraction of the acquisition time. For standard detectors such as a CCD camera, SIM requires a minimum of three sequential frame captures, limiting its usefulness to static objects. By using a color grid and camera, we surpass this limit and achieve optical sectioning with just a single image acquisition. The extended method is now applicable to moving objects and improves the speed of three-dimensional imaging of static objects by at least a factor of three.     

Two-photon fluorescence isotropic-single-objective microscopy

Two-photon excitation provides efficient optical sectioning in three-dimensional fluorescence microscopy, independently of a confocal detection. In two-photon laser-scanning microscopy, the image resolution is governed by the volume of the excitation light spot, which is obtained by focusing the incident laser beam through the objective lens of the microscope. The light spot being strongly elongated along the optical axis, the axial resolution is much lower than the transverse one. In this Letter we show that it is possible to strongly reduce the axial size of the excitation spot by shaping the incident beam and using a mirror in place of a standard glass slide to support the sample. Provided that the contribution of sidelobes can be removed through deconvolution procedures, this approach should allow us to achieve similar axial and lateral resolution.     

一种提高共聚焦显微镜信噪比算法的研究

基于共焦显微镜的成像特点,建立了Kalman滤波算法的理论模型,把Kalman滤波方法引入到系统中,提出一种基于图像像素的Kalman滤波算法,并实现了实时化的Kalman滤波器。实验结果表明:该算法能够有效地提高共焦显微镜信噪比,但是以牺牲时间为代价,提高系统分辨率的根本方法还是要着重考虑优化成像系统光路和探测电路。     

Coherent super-resolution microscopy via laterally structured illumination

Theory describing a super-resolution microscopy experiment using temporally and spatially coherent structured illumination was developed, and used to derive a method for processing experimental data. Numerical simulations were performed to verify that the method can, in principle, produce super-resolved images that are exactly equivalent to an image processed by a system with a much larger aperture (that is, the correct weighting between different regions of the image spectrum is maintained). The process was then demonstrated experimentally, showing a factor of two improvement in resolution over a diffraction-limited, coherently illuminated, microscope.