导向溶栓分子scFv—UK32中连接钛的引入和在昆虫细胞中的表达

为了提高重组导向溶栓分子scFv-UK32的溶纤活性,通过重组PCR方法在编码scFv与UK32的碱基之间引入编码KLGGGG连接肽的碱基序列,并克隆到转移载体pBacPAK9上,通过与线性病毒DNA BacPAK6/Bsu361 digest共转染到昆虫细胞Sf 9内,进行表达。表达产物分泌到上清中,共转染后第5d（天）用纤维平板法测得Sf 9细胞上清溶纤活性达到107IU/mL,比未引入连接肽的scFv-UK32的表达活性（25IU/mL）高。,ELISA实验表明共转染上清具有明显对活化血小板特异结合能力,Western Blotting实验表明共转染上清可与Pro-UK的单抗特异结合。     

神经生长因子基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

以人胎盘组织DNA为模板,经PCR扩增出包含信号肽,前肽和成熟肽部分的prepro-NGF序列,经序列分析后克隆至转移载体pFastBac1中得到pFastBac-NGF,再将其转化含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac,发生转座作用后,得到含NGF基因的重组穿梭载体rBacmid-NGF,用纯化的rBacmi...     

人粒细胞集落刺激因子在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿尺核型多角 体病带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标志的非融合蛋白基因转移载体ｐＢＢ成功地构了重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ－Ｇ－ＣＳＦ．在感染重组病毒的草地夜蛾细胞中ｈＧ－ＣＳＦ得到了高效表达。表达产物由ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检出，其分子量约为１９ＫＤａ。     

重组人神经生长因子昆虫表达载体的构建及表达

目的:构建重组人神经生长因子(rh-NGF)杆状病毒表达载体,转染昆虫细胞从而获得目的蛋白的大量表达.方法:从人胎盘组织中提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增-NGF基因片段,经BamHI、HindⅢ双酶切后插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTM-Dual+[rh-NGF].对构建的载体进行PCR和酶切鉴定并测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA对rh-NGF的表达进行检测.结果:构建的rh-NGF基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA检测结果显示病毒感染的Sf9细胞可表达rh-NGF.结论:成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[rh-NGF],并在昆虫细胞系Sf9中得到表达,为大量制备重组人神经生长因子奠定了基础.     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌－杆状病毒穿梭系统将一套含有绿色荧光蛋白基因和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地殂多角体。     

导向溶栓分子scFv-UK32中连接肽的引入和在昆虫细胞中的表达

为了提高重组导向溶栓分子scFv-UK32的溶纤活性,通过重组PCR方法在编码scFv与UK32的碱基之间引入编码KLGGGG连接肽的碱基序列,并克隆到转移载体pBacPAK9上,通过与线性病毒DNA BacPAK6/Bsu36I digest共转染到昆虫细胞Sf 9内,进行表达.表达产物分泌到上清中,共转染后第5d(天)用纤维平板法测得Sf 9细胞上清溶纤活性达到107 IU/mL,比未引入连接肽的scFv-UK32的表达活性(25 IU/mL)高.ELISA实验表明共转染上清具有明显对活化血小板特异结合能力.Western Blotting实验表明共转染上清可与Pro-UK的单抗特异结合.     

导向溶栓分子scFv-UK32中连接肽的引入和在昆虫细胞中的表达

为了提高重组导向溶栓分子scFv-UK32的溶纤活性,通过重组PCR方法在编码scFv与UK32的碱基之间引入编码KLGGGG连接肽的碱基序列,并克隆到转移载体pBacPAK9上,通过与线性病毒DNA BacPAK6/Bsu36I digest共转染到昆虫细胞Sf 9内,进行表达。表达产物分泌到上清中,共转染后第5d(天)用纤维平板法测得Sf 9细胞上清溶纤活性达到107 IU/mL,比未引入连接肽的scFv-UK32的表达活性(25 IU/mL)高。ELISA实验表明共转染上清具有明显对活化血小板特异结合能力。Western Blotting实验表明共转染上清可与Pro-UK的单抗特异结合。     

两昆虫杆状病毒诱导的细胞凋亡

首次发现粉纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒和中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒分别诱导斜纹夜蛾细胞Ｓｌ－ｚｓｕ－１和纹夜蛾细胞Ｔｎ－５Ｂ１－４发生典型的细胞凋亡。     

诺如病毒衣壳蛋白在Tn5细胞中的表达及纯化

将人诺如病毒VA387株ORF2基因插入载体pFastBac1中,转化DH10Bac感受态细胞获得Bacmid-NoV-ORF2;脂质体介导转染sf9昆虫细胞,获得表达NoV-ORF2的重组杆状病毒Ac-NoV-ORF2.冻融破碎经Ac-NoV-ORF2感染的Tn5细胞,离心收集上清进行分子筛纯化.10%SDS-PAGE分析结果显示,重组病毒感染的Tn5细胞可见特异的蛋白条带;目的蛋白条带为相对分子质量59kD和56kD的两个条带;电镜观察发现表达的诺如病毒衣壳蛋白成功装配成了大小约为40~50nm的VLPs.结果表明在Tn5细胞中实现了诺如病毒衣壳蛋白的表达和VLPs的装配.     

疏水层析在分离纯化里氏木霉重组t-PA中的应用

疏水层析是一种有效的分离纯化手段,本文采用Octyl Sepharose和Butyl Sepharose两种疏水层析填料对里氏木霉表达的t-PA的提纯操作条件进行了初步研究。结果表明,选用Butyl Sepharose FF填料,上样量10mL（蛋白含量4．1mg／mL),用15％(NH4)2SO4的PBS以2mL／min的流速进行洗脱时,回收的酶的比活性较大,为2959．54U／mg,纯化倍数为5．16,回收率为7．12％。     

分泌性BACE1蛋白在昆虫细胞的表达

为了获得有活性的重组β-secretase并研究其功能,寻找特异性抑制剂,应用RT-PCR技术,从人胚胎脑组织特异性扩增并克隆了人BACE1编码基因的胞外片断(BACE1-454)。测序后与质粒pFastBac连接,得到含BACE1-454基因的重组质粒pFast-BACE1-454。将其转化到含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对重组穿梭载体Bacmid-BACE1-454进行鉴定。将Bacmid-BACE1-454经脂质体介导转染Sf9细胞,收获病毒。用重组杆状病毒颗粒感染昆虫细胞,表达蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在昆虫细胞中的胞内表达

通过基因重组的方法,在昆虫细胞胞内表达了猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B和C抗原位点片段.表达蛋白经Dot-ELISA检测具有良好的抗原性.本研究为TGEV的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础.     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.     

新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a( ),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210 μg/L.     

PRV闽A株gE基因抗原编码区片段在昆虫细胞中的表达研究

伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E是一种在伪狂犬病的根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因抗原编码区片段克隆到杆状病毒Bac-to-Bac系统表达载体pFastBacHTa中,获得的重组表达载体pFastBacHTa-FS转化大肠杆菌DH10BAc感受态细胞后,得到的重组Bacmid DNA在脂质体介导下转染粉蚊夜蛾Hi5细胞,通过细胞内同源重组,获得了含目的片段的重组病毒.此重组病毒感染Hi5细胞后72 h,细胞总蛋白的SDS-PAGE与Western-Blot结果表明,gE基因抗原编码区片段在Hi5细胞中得到了正确表达,表达产物约35000,占细胞总蛋白的9.31%.溶解性分析显示该片段在Hi5细胞中为不可溶性表达.     

从寄主昆虫血淋巴中分离纯化病原真菌菌体的方法

采用正交实验方法,对东亚飞蝗（Locusta migratoria）血细胞裂解及其DNA和RNA降解的条件进行了优化．在优化条件下,不仅去除了感病东亚飞蝗血淋巴中的血细胞及DNA和RNA。而且成功地分离和纯化了绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌体．裂解血细胞及其DNA和RNA的最佳酶解条件为：蛋白酶K的浓度为1mg／mL,作用温度为26℃,时间为60min,脱氧核糖核酸酶（DNAase I）的用量为5U,核糖核酸酶（RNAaseA）的浓度为0．5mg／mL,作用时间为35min,作用温度为30℃．以蝗虫特异引物进行PCR及RT-PCR检测结果表明,从绿僵菌侵染后的蝗虫血淋巴中分离纯化无蝗虫DNA和RNA污染的绿僵菌菌体,为后续分离和克隆绿僵菌侵入蝗虫体内后表达的基因,研究它们在致病机理中的作用奠定了基础．     

几种诱导昆虫细胞RNA干扰质粒的构建和效果比较

构建了四种可以在昆虫细胞中表达形成dsRNA的质粒,比较了其诱导RNA干扰,抑制目标基因———绿色荧光蛋白(GFP)基因表达的效果.四种质粒都不同程度地抑制了质粒介导的GFP表达,其中尤以单个果蝇hsp70启动子表达反向重复序列,并带有杆状病毒AcMNPV增强子hr5的质粒效果最佳,使GFP表达量下降到原来的3.9%.当用于抑制由杆状病毒介导的GFP表达时,以两个相向排列的AcMNPV ie1基因启动子的构造有明显的抑制效果.这些结果对于在昆虫细胞中有效地利用RNA i研究基因功能有参考意义.     

丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制昆虫细胞表达的蛋白质降解

干细胞因子是一种多功能细胞因子,能在多级造血水平与其他细胞因子协同作用促进造血干/祖细胞及各种血细胞的存活、增殖和分化.重组人二连体干细胞因子具有比干细胞因子单体更高的比活,可以避免副反应.重组人二连体干细胞因子在Sf9细胞和大肠杆菌中表达时,发现有特异性降解.片段缺失实验证实切割位点位于重组人二连体干细胞因子的145位到165位氨基酸之间.丝氨酸蛋白酶抑制剂aprotinin和PMSF能抑制这种特异性降解.试验了不同浓度的aprotinin和PMSF对Sf9细胞存活和重组人二连体干细胞因子产量的影响,显示当aprotinin的浓度为1.0μg/mL时,重组人二连体干细胞因子的产量是没有加aprotinin时产量的2倍,而且aprotinin可以完全抑制这种特异性降解.