基于Taqman微流控芯片技术高通量检测17种转基因玉米品系

将Taqman微流控芯片技术应用于实时荧光PCR平台的转基因玉米17种品系高通量检测。在一次PCR扩增过程中,以2个玉米内源基因(hmgA基因、adh1基因)和1个上样控制基因(18S基因)为内参照,可同时完成17种转基因玉米品系(TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、MIR162、GA21、DAS40278、BT176、BT11、98140、59122、3272、MON89034、MIR604、MON88017、T25)的单孔单重扩增的并行检测,检出限可达10～20 copies。本方法特异性强,灵敏度高,与"金标准"单一的实时荧光PCR方法检测结果完全吻合,具有可多样品、多靶标平行检测的优势,为转基因产品多品系混杂鉴定检测提供了高效、快速的方法。采用本方法,从16批进境的实用玉米中检出9批转基因玉米样品,且发现其中不同程度的混杂含有1～8种品系。本方法可用于口岸进境实用农产品中多品系混杂转基因的高通量检测。     

转基因玉米的多重PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光检测方法研究

采用三重PCR反应, 同时扩增CaMV 35S启动子、 hsp70 intron1和CryIA(b)基因之间序列以及Invertase基因, 扩增产物用无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光检测, 从而建立了多重PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光快速检测转基因玉米的新方法. 对影响多重PCR扩增和毛细管电泳的因素进行了优化. 在优化的条件下, 本方法可以同时检测转基因玉米样品中3种外源基因. 经序列测试证实, 三重PCR 扩增产物的序列与原基因完全一致, 表明扩增结果可靠. 该方法能检出0.05% MON810转基因玉米成分, 远低于欧盟对转基因食品规定标识的质量分数阈值(1％). 该方法对玉米及其制品的检测结果与实时荧光PCR方法的检测结果一致, 与传统的琼脂糖凝胶电泳法相比, 具有特异性高\, 快速及灵敏等优点, 适用于玉米中转基因成分以及转基因玉米MON810品系的快速筛选、 鉴定和检测, 能满足我国实施转基因食品标签法规的要求.     

牛奶α-乳白蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用Taqman探针技术,建立食品中牛奶过敏原α-乳白蛋白基因的实时荧光定量PCR检测方法。根据α-乳白蛋白基因序列设计特异性引物及Taqman探针进行PCR扩增,构建质粒,经酶切鉴定测序后,建立拷贝数(copies)-Ct标准曲线。成功克隆α-乳白蛋白目的基因,建立的标准曲线在1.12×103~1.12×108 copies范围内线性关系良好,灵敏度高,液体样品检测限达到1 000copies/mL,特异性强,稳定性好。该法可用于实际商品中牛奶过敏原α-乳白蛋白组分的定量检测。     

复合式蝎形引物实时定量检测端粒酶延伸产物

针对端粒酶延伸产物中靶基因序列的特殊性,开发了一种可产生荧光的复合式蝎形引物,该引物的5'端带有可特异性检测靶基因的探针序列,PCR阻断剂将其与引物序列连接.当复合式蝎形引物延伸,探针序列与同一分子内的靶基因杂交,荧光信号产生.运用该技术,建立了定量检测端粒酶延伸产物的实时荧光PCR方法.该法可在快速PCR循环条件下,对0.15～1.50×10³ amol/μL范围内的样品进行定量检测,线性相关系数R²=0.9992.该法操作简便,无需PCR后额外的检测步骤.     

分子生物学手段检测转Bt基因棉花中Cry杀虫蛋白的定性和定量方法

建立了转Bt基因棉花中Cry杀虫蛋白的提取、样品前处理以及酶联免疫(ELISA)定量分析方法,并使用凝胶电泳、普通聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR等分子生物学手段对转基因棉花中的Bt基因进行定性和定量检测.所建立的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白(Cry1Ab蛋白和Cry1Ac蛋白)标准曲线线性关系良好,相关系数r2均大于0.999,相对标准偏差RSD均小于2.0%.方法简单、快速、重现性和精密度好,可为农业食品行业和环境领域科研人员提供一种简便快速地从转基因棉花中检测Bt毒蛋白的分析方法.     

一种快速鉴别食用油的气相色谱指纹法

本发明公开了提供一种实时荧光定量PCR检测HC．MVgBn的分型方法,在PCR反应体系中加入荧光探针,利用荧光信号积累实时监测PCR进程,进行定量定性分析确定HCMVgBn型。本发明封闭反应,无需PCR后处理,避免污染;特异性强,灵敏度高采用对数期分析,摒弃终点数据,定量准确;实时荧光定量PCR技术既可对HCMVgB进行分型,又可对其进行定量;仪器在线式实时检测,结果直观,避免人为判断;可实现一管双检或多检;操作安全,缩短时间,     

碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量

建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称"SRPP").先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量.用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异.     

数字PCR技术的发展及应用

数字PCR(Digital PCR, dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比,数字PCR 技术不依赖于标准曲线,具有更高灵敏度、准确度及高耐受性,可实现对样品的绝对定量分析。近年来,随着微流控技术日臻成熟,基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展,在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。     

基于微磁珠分离技术的适配体实时定量PCR检测方法

利用适配体的识别能力和可扩增性, 构建了基于微磁珠分离技术的适配体实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法. 通过微磁珠偶联的互补链与适配体序列之间的碱基配对结合, 有效除去溶液中未与靶分子结合的适配体序列, 采用实时定量PCR技术测定上清液中结合态的适配体序列浓度, 从而间接实现对靶分子的定量检测. 分别选取代表生物大分子和有机小分子的凝血酶和ATP作为检测对象, 验证了该方法的普适性. 研究结果表明, 在获取特异性适配体序列后, 仅需简单优化其互补链序列, 即可对超低含量的凝血酶和ATP进行准确定量, 检出限分别为50 pmol/L和5 μmol/L. 该方法具有同时适用于高特异性和高灵敏度地检测生物大分子和有机小分子的优势.     

茎环引物实时定量PCR技术用于检测异核苷修饰的siRNA的可行性研究

本文考察了茎环引物实时定量PCR技术用于定量检测D-/L-异核苷(D-/L-iso NA)修饰的siRNA的可行性.根据阈值循环数(Ct值)及异核苷修饰的siRNA模板的初始浓度的对数值(lgC)绘制了标准曲线,与siRNA的标准曲线进行对比,发现D-异尿苷(D-isodU)修饰的siRNA(D-isodU-siRNA)不影响茎环引物实时定量PCR过程,而L-isodU修饰的siRNA(L-isodU-siRNA)降低了逆转录效率,而使测得的Ct值偏高,且对逆转录效率的影响有浓度依赖性和修饰位点特异性.因此,对前者既可进行绝对定量也可进行相对定量,对于后者只能进行绝对定量.将上述方法应用于isodU-siRNA血清稳定性的检测,获得了更可靠的定量结果.运用双标准曲线法,可进行胞内isodU-siRNA的定量检测.