去B链羧端七肽胰岛素晶体结构的测定

去B链羧端七肽胰岛素(DHPI)晶体中不对称单位合二个分子,空间群P2_12_12_1。运用Patterson搜索技术确定了二个分子在晶胞中的取向,联合运用平移函数和R因子搜索测定了两个分子各自在晶胞中的位置。运用生物大分子刚体最小二乘修正技术和能量极小化最小二乘制约修正精化分子的取向和位置后,在6分辨率晶体学R因子下降到0.384。初始Fourier图显示,与天然胰岛素分子相较,DHPI分子的B链N端(B1—B8)和C端(B20—B23)肽段的构象有剧列变化,但A,B链的三段螺旋及其相对配置大体保持。     

去B链N端二肽(B_(1—2))猪胰岛素晶体结构的研究——单晶培养及X射线晶体学的分析

利用微量过饱和静置法,在柠檬酸缓冲液中培养出可供X射线结构分析用的去B链N端二肽(B_(1-2))猪胰岛素单晶。晶体衍射分辨率达到4.0A以上。晶体属于立方晶系,a=97.43A,空间群为P4_132(或P4_332),每个结晶学不对称单位含两个或三个去B链N端二肽(B_(1-2))猪胰岛素分子。本文对单位晶胞内六聚体之间和二聚体之间可能的堆积方式进行了讨论。     

B链羧端去三肽(B28～B30)胰岛素晶体结构

采用悬滴气相扩散法，获得了Ｂ链羧端去三肽胰岛素３种晶型的单晶体，其中 晶型１属于Ｐ２_1空间群，晶胞参数为ａ＝４．７７ ｎｍ，ｂ＝６．１９ ｎｍ，ｃ＝６．１２ ｎｍ，β＝１１０．３°；晶 型２属于Ｐ４_１２２或Ｐ４_３２２空间群，晶胞参数为ａ＝ ６．４５ ｎｍ， ｃ＝ １２．０７ ｎｍ；晶型３属于 Ｐ２_１２_１２_１空间群，晶胞参数为 ａ＝ ４．９８ ｎｍ， ｂ＝ ５．１６ ｎｍ， ｃ＝ １０．０６ ｎｍ．采用分子置换法， 测定并精化了 Ｂ链羧端去三肽胰岛素晶型１的 ０．２３ ｎｍ分辨率晶体结构．最终模型的 Ｒ 因子为１８．８％，键长和键角与标准键长和键角的均方根偏差分别为０．００１５ ｎｍ和３．３°． 晶体结构的结果表明， Ｂ链羧瑞去三肽胰岛素失去了对缔合有重要作用的 Ｂ２８ Ｐｒｏ后， 虽然仍能形成六聚体，但表现出比天然胰岛素更易解聚的结构变化。     

白鲢鱼胰岛素的晶体学研究

本实验获得了白鲢鱼胰岛素的单晶体并收集了2.8A分辨率的强度数据.确定晶体所属空间群为 P2_12_12_1,晶胞参数是a=96.73(8)A,b=57.74(7)A,c=53.88(9)A.每个不对称单位含有6个胰岛素分子.用旋转函数法揭示出非晶体学三重轴和二重轴的取向,并说明了白鲢鱼胰岛素具有与三方二锌猪胰岛素相似的空间结构和聚合状态.本文讨论了一级结构的变化对胰岛素的结晶行为和堆积方式的影响。     

白鲢鱼胰岛素的晶体结构测定

本文继用旋转函数方法对白鲢鱼胰岛素分子在P2_12_12_1晶胞中的取向分析之后,以已知的二锌猪胰岛素分子为模型,应用平移函数及R因子搜索方法,确定了白鲢鱼胰岛素六聚体在晶胞中的位置。在这样得到的模型晶胞中,分子的堆积合理。利用现有的3.5衍射数据,对该模型进行了初步的约束参数最小二乘修正。用修正过的原子参数算得的电子密度图上,未投入修正的多肽链片段有相应的表现。     

去B链C端六肽胰岛素及其类似物的酶促合成

本文报道了用胰蛋白酶合成肽键的方法从[Msc]_2-DOI制备结晶的DHI和均一的B23-Ala-DHI。酶促合成的最适pH为7.0—7.5。结晶DHI的整体活力为胰岛素活力的40％,而与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力只有胰岛素的2.1％。对于这一差异进行了讨论。B23-Ala-DHI的整体活力只有胰岛素活力的2％。本文还报道了结晶DOI以及DHI等胰岛素类似物的CD光谱。     

带保护基的胰岛素A链羧端十二肽的合成

已知合成的胰岛素A链羧端带保护基的十二肽酯Ⅰ在不同条件下皂化,得十二肽Ⅱ,其物理性质略有差异,经制成牛胰岛素A链井进一步制成半合成牛胰岛素粗产物后,其生物活力相当于天然胰岛素的1—4％。根据二条不同的路线直接合成了带保护基的胰岛素A链羧端十二肽Ⅱ,路线一:由已知的四肽Ⅲ制成其酰肼衍生物,再转变为相应的迭氮化物后与脱N-苄氧羰基和γ-叔丁基的五肽Ⅴ(即Vb)缩合成九肽Ⅵ,Ⅵ经脱除N-保护基后与已知的三肽酰肼Ⅶ以迭氮化物法缩合郎得十二肽Ⅱ.路线二:三肽酰肼Ⅶ先制成迭氮化物再与脱N-保护基的已知二肽酯ⅩⅩⅢ反应成五肽酯ⅩⅩⅣ,再经肼解得五肽酰肼ⅩⅩⅤ,然后按迭氮化物法与脱苄氧羰基的二肽Ⅹ缩合成七肽酯ⅩⅩⅥ,再肼解得七肽酰肼ⅩⅩⅦ,最后通过迭氮化物法与五肽V_b缩合,亦得相同的十二肽Ⅱ.由这两种方法直接合成的十二肽Ⅱ,其质量较皂化所得为优,并已用于牛胰岛素A链的合成与结晶牛胰岛素的半合成和全合成。五肽Ⅴ和七肽ⅩⅩⅥ都曾各按二条不同的路线合成,而得到相同的产物,本文报导的合成肽段均经分析证明为化学纯的均一物质。     

重组人胰岛素注射液中B3和B3iso脱氨人胰岛素的分析与鉴定

建立了有效分离重组人胰岛素注射液中B3和B3iso脱氨人胰岛素的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,并采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术(HPLC-MS/MS)对其进行氨基酸序列的鉴定。在《中国药典》2010版重组人胰岛素注射液有关物质检查分析方法的基础上,优化流动相p H值,以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(p H 3.6)-乙腈(90∶10)作为A相,乙腈-水(50∶50)为B相,梯度洗脱,分别收集杂质峰1和杂质峰2,脱盐浓缩后,用丝氨酸蛋白酶(V8酶)酶切,取部分酶切溶液经三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原,分别得到还原和非还原肽段溶液,利用LC-MS/MS鉴定氨基酸序列,未知杂质分别为重组人胰岛素B3位发生脱氨和异构化的产物,即B3和B3iso脱氨人胰岛素。将优化后的方法与《中国药典》方法对市售重组人胰岛素注射液进行有关物质的对比分析,已上市厂家的重组人胰岛素注射液均有不同程度的B3和B3iso脱氨人胰岛素存在。该方法不影响重组人胰岛素其它有关物质的检测,可用于监控人胰岛素注射液产品储存过程中脱氨类杂质的增长趋势。     

CRYSTALLOGRAPHIC STUDIES ON DESHEPTAPEPTIDE (B24-30) INSULIN——GROWTH OF SINGLE CRYSTAL AND DETERMINATION OF ITS CRYSTALLOGRAPHIC PARAMETERS

Satisfactory single crystals of desheptapeptide (B24----30) insulin for X-ray crystal struc-ture analysis have been grown in citrate buffer by still-setting method. The diffraction ofthe crystal extends to 2 A spacing. Its crystal system is orthorhombic space group P2_12_12_1.Each crystallographic asymmetric unit contains two molecules of desheptapeptide insulin.     

胰岛素的闪光光解研究

本文给出胰岛素和去B链羧端五肽胰岛素(DPI)紫外光解的原初产物的瞬态吸收光谱,并与游离态酪氨酸进行比较.光谱的远紫外区(<300毫微米)未见有过报道.胰岛素和DPI的原初光产物主要是对位α-氨基丙酸苯氧自由基(λ_(max)=410,390毫微米)和另一种未知自由基(λ_(max)=270毫微米),它们的产额与酪氨酸残基酚环上羟基的解离率平行对应,而解离率又依赖于残基的暴露程度.实验测定了胰岛素和DPI光解产生苯氧型自由基的量子产额并与游离态酪氨酸比较,给出了这两种蛋白质分子中光易变的酪氨酸残基数,这个光易变性参数将为胰岛素和DPI分子中酪氨酸残基的暴露情况提供较定量的信息。     

苄氧羰酰脯氨酰丙氨酰苏氨酰叔丁酯晶体结构的研究

用X射线晶体学方法测定了含有保护基的三肽(Z-Pro-Ala-Thr(But)_2)的晶体结构和分子构象.其结晶属正交晶系,空间群为P2_12_12_1,晶胞参数a=29.557A,b=11.583A,c=8.830A,z=4.用PW-1100四圆衍射仪收集衍射强度数据,用直接法解结构,使用MULTAN-80计算机程序系统.用块矩阵最小二乘方法修正结构,最终的R=0.088(不包括氢原子). 分子中丙氨酸的构象趋近屏蔽式,形成肽链的转折.脯氨酸与保护基之间形成的“肽键“是顺式结构.脯氨酸侧链的吡咯烷环五个原子不在一个平面上,C~β和C~γ分别向相反方向偏离平面.相邻的肽基团平面之间的交角都接近90°.分子之间存在氢键,它使分子沿晶体z方向无限伸展形成分子链.晶体沿x和y方向的分子间作用力为范氏力.保护基(Z)在分子堆积中起重要作用。     

牛胰岛素A链的合成及其与天然B链组合成结晶胰岛素

本文报导了牛胰岛素A链的S-磺酸盐(Ⅰ)的合成以及自Ⅰ和天然B链S-磺酸盐(Ⅱ)组合为结晶牛胰岛素的半合成。十二肽酸Ⅴ脱N-保护基后,与九肽酰肼Ⅳ经迭氮化物法缩合得带保护基的A链(Ⅵ),粗产物经钠-液氨处理去保护基后,用乙酸缓冲液调至pH 3.8以除去部分杂质,然后进行S-磺酸化。经纸层析纯化的S-磺酸盐Ⅰ,其旋光率、纸电泳和纸层析的行为、氨基酸组成以及末端分析数据均与天然牛胰岛素A链S-磺酸盐的相符。产物Ⅰ与天然胰岛素B链S-磺酸盐经巯基乙酸还原和空气氧化后,得到的粗产物的生物活力相当于天然牛胰岛素活力的5—10％,经仲丁醇-乙酸柚提后,活力可提高5—10倍,抽提物再经含乙酸锌的丙酮-柠檬酸缓冲液纯化,可得结晶产物Ⅲ,其晶形与天然牛胰岛素相同,其活力(20—23国际单位/毫克)与后者相仿。上述结果及其他证据都证明我们已合成了牛胰岛素A链和所获得的半合成结晶产物就是结晶牛胰岛素。     

色氨酸胰岛素类似物的荧光研究

本文通过测定[L-Trp]~(A1)胰岛素、[D-Trp]~(A1)胰岛素、[L-Trp]~(B1)胰岛素以及去Phe~(B1)[L-Trp]~(B2)胰岛素的荧光随pH的变化等性质,探讨分子氨基末端的微环境及其侧链取向.3种L型色氨酸胰岛素类似物在pH2—13 的范围内的荧光行为类似,只显示一个在pH9的荧光强度峰,但[D-Trp]~(A1)胰岛素却有在pH9.8和pH5.5 两个荧光强度峰.从两种A1色氨酸胰岛素类似物的荧光特性推测到它们溶液构象的差别,很可能是造成它们生物活力不同的原因之一。     

{[(C6H5)3P]2Cu}2B12H12配合物晶体和分子结构

{[(C_6H_5)_3P]_2Cu}_2B_(12)H_(12)配合物晶体属三斜晶系,空间群 PI,晶胞参数为 a=12.134(3),b=15.521(3),c=11.236(3)(?);α=94.41(2)°,β=115.41(2)°,γ=103.47(2)°;Z=1.结构通过重原子 Patterson 及 Fourier 法解出,经块对角矩阵最小二乘法修正,对3699个独立衍射点的计算,最终偏离因子 R 为0.084.结构测定表明,硼笼阴离子 B_(12)H_(12)~(2-)位于晶体对称中心上,它通过两个螯合环■分别与以对称中心相联系的两个Cu(Ⅰ)原子配位,每个Cu(Ⅰ)原子进一步得到两个三苯基膦配位,形成近似四面体的配位结构.硼笼 B_(12)H_(12)~(2-)中的 B—B 平均键长为1.78■,B—H 为1.16■,Cu—P 和 Cu—B 的平均距离分别为2.270(4)和2.39(2)■.在螯合环■■的两个三中心键 Cu—H—B 中,Cu—H 的距离为1.82和1.88■,螯合环的五个原子几乎完全共面.     

CRYSTAL STRUCTURE DETERMINATION OF DESHEPTAPEPTIDE (B24—B30)-INSULIN

Desheptapeptide (B24—B30)-insulin (DHPI), an essentially inactive insulin analog, is crystallized in space group P2_12_12_1 with two molecules in an asymmetric unit. The orientations of the molecules in the crystal cell have been determined by using Patterson search method at 6 resolution and the positions of the molecules are deduced from translation function calculation and R search at 3. resolution. After using the rigid body refinement (CORELS) further to refine the orientational and positional parameters as well as the initial energy restrained refinement (EREF) for the model, the crystallographic R valueis reduced to 0.384 at 3 resolution. The initial Fourier map shows that the B-chain N-terminal (B1—B8) and C-terminal (B20—B22)segments, compared with the native 2 zinc insulin, exhibit drastic conformational changes, but the three helices of B- and A-chains and their relative arrangement are essentially kept in DHPI.     

一维链状冠醚配合物[K(B18-C-6)]_2[M(SCN)_4](M=Pd,Pt)的合成与结构

合成了苯并18-冠-6（B18-C-6）与K_2[Pd(SCN)_4]生成的配合物[K（B18-C-6 ）]_(12) [Pd(SCN)_4] (1), [K(B18-C-6)]_2[Pt(SCN)_4] (2)和[K(B18-C-6)]_2 [Pt(SCN)_4]·C_2H_4Cl_2 (3),并通过元素分析、红外光谱、单晶X射线衍射进行 了表征。1和2为单斜晶系,空间群P2_l/n,晶体学数据：1, a = 1.00970(17) nm, b = 1.3157(2) nm, c = 1.7303(3) nm, β = 94.841(2)°, V = 2.2852(7) nm~3, Z = 2, F(000) = 1136, R_1 = 0.0257。3为三斜晶系,空间群P1,晶体学 数据：a = 0.95914(18) nm, b = 1.2137(2) nm, c = 2313(2) nm, α = 63.693 (2)°, β = 76.293(2)°, γ-1.2406(4) n~3, Z = 1 F(000)618,R_1 = 0.0366 。在固态,三个配合物相邻的两个[K（B18-C-6）]~+基团通过冠醚氧化原子与钾的 子的相边接而形成一维链状结构。     

胰岛素单体的结构特征及其运动方式

运用最小二乘叠合技术及图象显示技术对已测定的不同种属和不同晶型的胰岛素及各种胰岛素衍生物空间结构进行了广泛的构象比较.研究结果表明:二锌胰岛素分子Ⅰ更接近于天然单体的结构;二体内两个分子之间的构象差异发生在二体形成过程中,并在六体形成及六体堆积过程中完善和稳定;通过一些铰链肽A10,B4,B8,B24,B20及B23,胰岛素分子内各结构片段之间具有较灵活的相对运动,羧端残基可能移动大于10A;由于所处的环境不同,各残基侧链的运动性差别很大.     

钴(Ⅱ)与2-[2-(6-甲基苯并噻唑偶氮)]-5-二乙氨基苯甲酸体系盐酸羟胺催化吸附波的研究

Co2 +_2_[2_(6_甲基苯并噻唑偶氮 )]_5_二乙氨基苯甲酸在硼砂 -NH2OH·HCl体系中有一灵敏的极谱波 ,其峰电位Vp 为 -594mV(vs.SCE) ,钴质量浓度在0.7～1000μg/L范围内与峰电流Ip′有良好的线性关系 ,检出限为0.16μg/L。经多种电化学方法证明该波为络合催化吸附波 ,其电极过程为不可逆过程 ,电子转移数为2 ,此外还试验了多种离子对峰电流Ip′的影响。所拟方法已用于维生素B12 中钴的测定 ,结果令人满意。     

担载于Al2O3和TiO2上的Pt3(CO)3(PPh3)4络合物热分解过程中的结构变化

用电子自旋共振、紫外漫反射谱、红外光谱和程序升温分解等法研究了Al_2O_3和TiO_2担载的Pt_3(CO)_3(PPh_3)_4络合物的表面结构和在真空及CO中的热分解。当络合物担载于Al_2O_3上时,其桥羰基和Pt—Pt骨架未发生明显变化,ESR谱表明络合物的一个PPh_3基被Al_2O_3表面的化学基团取代,形成了Pt_3(CO)_3(PPh_3)_3(B)(B=—O—Al或HO—Al)。在真空或CO中,表面络合物随温度升高而逐渐脱去羰基,分别出现相当于Pt(CO)_2(PPh_3)(B)和Pt(CO)(PPh_3)(B)_2的碳基吸收带。当络合物担载于TiO_2上时,在真空、CO或氦中升温时,结合物均发生分解而分别形成相当于Pt_3(CO)_3(PPh_3)_3(B),Pt(CO)(PPh_3)(B),Pt(CO)(PPh_3)(B)_2和Pt(PPh_3)(B)_2表面络合物。     

分子密堆积法及其在B链羧端去六肽(B25—30)胰岛素结构测定中的应用

基于分子密堆积原理我们定义了一个能够表达在单位晶胞中对称相关分子之间堆积相容性的密堆积函数,并在计算机上模拟晶格中的分子密堆积,同时计算该函数在分子的每个旋转及平移位置的值,使分子密堆积定量化。这一方法不仅可以从多个旋转函数或平移函数峰中判断出一个正确的解,而且可能独立地、定量地和快速地解决一些特殊的旋转及平移问题。用已知结构B链羧端去五肽胰岛素作为例子检验了分子密堆积法及其程序的有效性,并用分子密堆积法独立地解决了未知结构B链羧端去六肽胰岛素的平移问题.R因子搜索等方法证实了密堆积法的解的正确性。分子密堆积法可以作为一种既相对独立于分子置换法又与之相辅相承的方法。