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1.
以培养的原发性肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02为研究对象,采用细胞裂解液提取总蛋白,用PNGase F酶解释放N-糖链,以微晶纤维素柱结合石墨碳柱纯化分离N-糖链,通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对N-糖链进行序列鉴定,以β-环糊精为内标对2种细胞系的N-糖链进行了定量比较分析.结果表明,在肝癌细胞系HepG2和正常细胞系L02中共检测到26种N-糖链,与L02相比,HepG2的大多数高甘露糖型糖链、唾液酸化糖链和岩藻糖基化糖链的数量都明显升高,其中有15种糖链在数量上具有极显著性差异(p0.01),1种糖链具有显著性差异(p0.05).本研究为进一步探索肝癌中各类N-糖链的表达特点及发现早期肝癌糖链标志物提供了参考. 相似文献
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以培养的原发性肝细胞癌HepG2细胞和正常肝细胞L02为研究对象, 用细胞裂解液提取总蛋白, 然后采用Carlson还原性β-消除法释放O-糖链, 以阳离子交换柱结合C18柱纯化分离O-糖链, 用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对O-糖链进行序列鉴定, 以β-环糊精为内标对2种细胞系的O-糖链进行定量比较分析. 结果表明, 在肝癌细胞系HepG2中检测到10种O-糖链, 正常细胞系L02中检测到9种O-糖链, 其中9种O-糖链是2种细胞系中共有的, 但HepG2中存在癌细胞中特有的缩短的O-糖链N1A1(NeuAc-GalNAc, sialyl Tn 抗原). t检验结果表明, HepG2与L02相比, 在检测到的10种O-糖链中有5种的含量具有极显著性差异(P<0.01), 2种的含量具有显著性差异(P<0.05). 相似文献
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基于寡糖代谢工程结合质谱技术(MS结合MS/MS),对4种肿瘤细胞系和1种正常细胞系中的O-糖链进行了定性和相对定量比较分析.结果表明,4种肿瘤细胞系HeLa,SMMC-7721,HepG2和MCF-7中分别检测到19,11,6和5条O-糖链;在正常肝细胞系L02中检测到10条O-糖链.在对肿瘤和正常细胞系中表达的O-糖链进行定性和相对定量比较中发现,结构组成为N1,H1N1A1和H1N1A2的3种糖链在5种细胞系中均有表达;肿瘤细胞系表达的O-糖链的种类比正常细胞多,且岩藻糖基化和唾液酸化程度均高于正常细胞组.肿瘤细胞系中特有的O-糖链主要有岩藻糖化和唾液酸化修饰的Mucin型Core2结构糖链.MS/MS分析表明,其中岩藻糖基化修饰的O-糖链结构组成为H3N3F1A2,H4N4F1A2和H5N5F1A1,唾液酸化修饰的O-糖链结构组成为H5N4A1,H4N4A2和H5N5A2. 相似文献
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蛋白质的O-糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它和N-糖基化一样是蛋白质糖基化修饰的主要形式。蛋白质的O-糖基化对蛋白质的结构功能有重要的影响,因此分析蛋白质的O-糖基化具有重要的生物学意义。蛋白质O-糖基化分析包含4个方面的内容:(1)鉴定O-糖基化蛋白质的种类; (2)鉴定糖基化位点; (3)鉴定糖链结构; (4)糖链的定量分析。由于缺少保守的O-糖基化氨基酸特征序列,缺乏通用的糖苷酶以及O-糖链结构的复杂性等原因,基于质谱的蛋白质O-糖基化的分析目前仍处于方法开发阶段。本文主要介绍基于质谱的O-糖基化蛋白质的分析方法学在近期取得的一些进展,包括以下4个方面:O-糖蛋白/多肽的富集、O-糖链的解离、O-糖链的结构分析及O-糖基化定量分析。 相似文献
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以微量HeLa细胞(107个)为对象, 经细胞裂解、还原羧甲基化、胰酶降解和Oasis-HLB柱提取分离得到总糖肽后, 用PNGase F酶解释放N-糖链. 对所得N-糖链用Sep-Pak C18柱纯化后进行完全甲基化衍生, 再采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析HeLa细胞表面N-糖链的结构轮廓. 结果表明, 在获得的34种N-糖链中, 除高甘露糖型、二天线、三天线、四天线和五天线等N-糖链外, 还出现了在某种程度上与肿瘤发生转移相关的特殊平分型和Lewis结构. 利用MALDI-TOF MS技术可快速分析微量癌细胞表面N-糖链的结构轮廓, 为进一步寻找肿瘤糖链标志物及肿瘤的早期预防诊断提供技术支持. 相似文献
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以蚕茧丝胶蛋白源Tn抗原和T抗原为研究对象,采用“一釜法”、氨水催化法和链霉蛋白酶E(Pronase E)水解法对丝胶蛋白O-糖链进行释放,并通过固相萃取柱进行分级纯化,以高效液相色谱仪(HPLC)进行分离制备;利用电喷雾质谱(ESI-MS)、串联质谱(MS/MS)及在线液相色谱-质谱联用仪(Online LC-MS)进行了结构鉴定和定量分析.结果表明,丝胶蛋白中O-GalNAc含量为1.58μg/g, O-GalNAcGal含量为0.54μg/g,二者丰度比约为5.3∶1;并且氨水可高效释放出其还原性O-连接单糖GalNAc,通过液相色谱法可实现其精细分离纯化,而以等量Pronase E对丝胶蛋白水解可有效释放出Tn抗原和T抗原. 相似文献
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《化学进展》2010,(12)
蛋白质的O-糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它和N-糖基化一样是蛋白质糖基化修饰的主要形式。蛋白质的O-糖基化对蛋白质的结构功能有重要的影响,因此分析蛋白质的O-糖基化具有重要的生物学意义。蛋白质O-糖基化分析包含4个方面的内容:(1)鉴定O-糖基化蛋白质的种类;(2)鉴定糖基化位点;(3)鉴定糖链结构;(4)糖链的定量分析。由于缺少保守的O-糖基化氨基酸特征序列,缺乏通用的糖苷酶以及O-糖链结构的复杂性等原因,基于质谱的蛋白质O-糖基化的分析目前仍处于方法开发阶段。本文主要介绍基于质谱的O-糖基化蛋白质的分析方法学在近期取得的一些进展,包括以下4个方面:O-糖蛋白/多肽的富集、O-糖链的解离、O-糖链的结构分析及O-糖基化定量分析。 相似文献
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针对糖组学分析面临的初始样本量需求较高的技术挑战,该研究发展了一种微量样本N-糖链制备技术(GPAT),通过在移液枪头(Tip)中分别装填C_(18)和HILIC填料,实现了一站式原位蛋白消化、N-糖链释放和富集。与目前普遍采用的基于过滤辅助样品制备(FASP)技术的N-糖组分析策略相比,使用GPAT技术可以实现微量免疫球蛋白G(IgG)和人肝癌HepG2细胞提取蛋白的原位N-糖链的释放和富集,样本起始量减少90%,可以从10μg IgG和10μg的HepG2细胞蛋白中分别检测到20条和39条N-糖链。从6例健康人(3例男性,3例女性)尿液中提取的10μg尿蛋白中检测到49条N-糖链。该方法实现了微量复杂蛋白样本N-糖链简便、快速的定量分析策略,为进一步的糖组学方法推广应用奠定了基础。 相似文献
10.
以β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)为研究对象,利用Trypsin和Pepsin酶对其进行水解,以Con A亲和层析柱富集纯化糖肽,并用糖苷酶PNGase F和Endo H分别酶解糖肽,再采用电喷雾质谱(ESI-MS)和串联质谱(MS/MS)对所得肽段的氨基酸序列及糖链的结构进行了分析,最后通过数据库检索对分析结果进行验证.结果表明,β-conglycinin具有5个N-糖基化位点,分别为α亚基的199和455位天冬酰胺(Asn),α'亚基的215和489位Asn及β亚基的326位Asn,且每个糖基化位点均被H5N2,H6N2,H7N2和H8N2这4种高甘露糖型N-糖链所修饰.本研究为各种糖蛋白的糖基化位点及其对应的糖链结构的鉴定分析提供了方法参考,并为深入理解大豆糖蛋白抗原表位的特异性及致敏机理提供了依据. 相似文献
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基于电喷雾电离质谱检测技术,建立了一种可靠、高效、简单,适合于微量糖蛋白N-糖链解离、富集纯化的方法.以糖蛋白牛胰核糖核酸酶(Rib B)和卵清白蛋白(OVA)为模型蛋白直接酶解,比较了4种方法纯化酶解样品的效果.比较了直接酶解和经过聚偏氟乙烯(PVDF)膜富集后酶解微量复杂生物来源样品胎牛血清的酶解效果,最终建立了微量生物样品中糖蛋白N-糖链的质谱分析前处理方法.采用PVDF膜吸附复杂生物样品中的糖蛋白,N-糖苷酶F(PNGase F)酶直接在膜上完成糖链释放(37℃,24 h),采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化,用于微克级胎牛血清和健康人血清中N-糖链质谱分析的前处理.本方法通用性好,在微量生物样品糖链质谱分析检测的前处理方面具有一定应用价值. 相似文献
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采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)准内标法准确测定重组人血小板生成素(rhTPO)仿制药和原研药中4类糖修饰的相对含量,并进行样本间和批间一致性比较。结合多种切糖酶逐步切除rhTPO的N-糖、唾液酸和O-糖;以牛血清白蛋白(BSA)为标准品,与样本非混合点靶;采用MALDI-TOF质谱准内标法检测,分别获得各样本完整含糖分子量及不同层次切糖后分子量;通过分子量差值计算4类糖修饰的相对含量;最后比较仿制药与原研药样本间和批间一致性。以BSA多电荷峰对rhTPO切糖前后的MALDI-TOF质谱测定值进行准内标法校正,BSA多电荷峰之间相对标准偏差(RSD)均≤0.075%,批间RSD为0.001%~0.004%,方法误差均0.01%。rhTPO仿制药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,批间一致性良好,且总糖含量与文献值一致;rhTPO原研药N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相对含量分别约为25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,总糖含量较文献值偏低。与rhTPO原研药相比,仿制药糖基化糖相对含量基本一致,糖化糖含量有差异。rhTPO糖化糖研究未见文献报道,其差异是不同厂家rhTPO之间差异的重要因素,主要由发酵工艺差异导致。 相似文献
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基于Endo-M N175Q糖链转移反应与丙酮富集糖肽的LC-MS分析糖蛋白N-糖链 总被引:1,自引:0,他引:1
基于化学酶标记和丙酮富集糖肽方法,建立了一种可靠、有效、简单的糖蛋白N-糖链分析方法。以唾液酸糖肽(SGP)为模型糖肽,比较了样品中丙酮加入量对SGP的富集效果,最终选择加入样品体积5倍量的丙酮。用丙酮富集经胰蛋白处理的核糖核酸酶B(RNase B)酶解液中的糖肽,以富集分离得到的糖肽(糖基供体)和PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(糖基受体)作为酶反应底物,进行Endo-M N175Q的转糖基反应,得到PDPZBoc-Asn-GlcNAc-N-糖链标记物。采用YMC C18色谱柱为分析柱,10 mmol/L甲酸铵-乙腈为流动相梯度洗脱,经液相色谱-串联质谱(LC-MS)检测得到5种高甘露糖型糖链。结果表明,丙酮可有效地富集大量肽和少量糖肽混合溶液中的糖肽,Endo-M N175Q可将天然糖肽的糖链转移到PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc受体上。将该方法应用于胎球蛋白N-糖链分析,检测到5种复杂型N-糖链。该研究为各种糖蛋白N-糖链检测提供了新的分析方法。 相似文献
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本文发展了一种新型"双重衍生化"策略,即首先以甲胺化衍生修饰酸性聚糖中的唾液酸残基,然后采用吉拉尔特试剂P(GP)对N-糖链还原端进行标记,最后以基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测。该衍生化方法不但保护了酸性聚糖中的唾液酸残基,而且大大提高了N-糖链的离子化效率。采用该方法,在25ng人血清样品中成功检测出16种N-糖链,其中包括9种酸性糖链和7种中性糖链,为中性、酸性N-糖链的同时检测提供了新的途径,并有望将其用于疾病相关糖链标志物的研究。 相似文献
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以二苯甲酮(Benzophenone,BP)为光化学反应的反应物,建立了乳腺细胞中不饱和卵磷脂双键位置和双键异构体相对含量的在线光化学反应-脉冲直流电喷雾串联质谱(PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS)的检测方法.通过三相萃取法提取细胞中的脂类,在254 nm紫外光的照射下,使不饱和卵磷脂中的C詤C和BP中的羰基发生特异性的环加成反应(Paternó-Bǜchi,PB反应),将反应后的PB产物通过非接触式的脉冲直流电喷雾(Pulsed directed current electrospray,pulsed-dc-ESI)方式电离,并进行低能碰撞裂解得到二级串联质谱(MS/MS),从得到的二级谱图的子离子中可以获得双键位置以及双键异构体相对含量的信息.检测了癌细胞MCF-7和正常细胞MCF-10A中8种不饱和卵磷脂中的双键位置,且对其中4种双键异构体的相对含量进行分析,发现PC 16:018:1中△9异构体的含量在两种细胞中差异不明显,PC 18:018:1和PC 18:118:1中△9异构体的含量略有差异,LPC 18:1中△9异构体的含量在癌细胞和正常两种细胞中差异比较明显(56.0%±1.3%vs.71.7%±6.8%).本方法快速简易,可用于分析双键位置及双键异构体相对含量,有望对不同细胞状态以及不同疾病状态进行鉴别. 相似文献
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液相色谱-电喷雾电离质谱与电子轰击质谱联用筛选百合中的甾体皂甙 总被引:10,自引:0,他引:10
利用高效液相色谱 电喷雾电离质谱联用仪 (HPLC/ESI MS)、电子轰击质谱 (EI MS)和半制备型高效液相色谱 ,从卷丹百合中筛选出了两种甾体皂甙 ,其中一种为含有 3个糖基与提果皂甙元的甾体皂甙 ,另一种为含有 3个糖基和薯蓣皂甙元的甾体皂甙。结果表明 :在线的HPLC/ESI MS能够准确快速地提供糖甙类化合物的分子质量和糖链部分的有益信息 ,但对甙元部分提供的信息极少 ;离线的EI MS只需极少量 (1mg~ 2mg)的纯品就能准确地提供甙元部分的有益信息 ,但很难获得糖甙的分子离子峰与糖链部分的信息 ,两者有机地结合起来能快速地从植物中筛选甾体皂甙。 相似文献