利用反向 PCR 鉴定沼泽红假单胞菌中野生质粒

为准确研究沼泽红假单胞菌的野生质粒及其携带的基因信息,在常规碱裂解法基础上,对沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352中野生质粒提取方法进行了优化,优化方法具有易操作、耗时少、纯度高等特点,所得质粒DNA纯度和质量均满足进一步分子操作的需要.同时,利用反向PCR技术鉴定该野生质粒,并结合生物信息学方法对其进行分析,比传统的质粒丢失法验证和考察质粒更为省时、可靠和直观.证明菌株携带4个野生质粒,其中2.3 kb的质粒序列与Escherichia coli pEC157 Rom-like protein gene有97.8%的同源性,推测1885~1887碱基为复制起点.     

一个假单胞菌MY1402基因启动子的分离与鉴定

利用构建的启动子探针载体pUE,以大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α作为宿主菌,从耐低温假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株MY1402分离基因启动子片段,获得7个具有不同大小的启动子功能片段的重组子,命名为pUE1～pUE7.将其中具有p1片段的重组子PUE1导入假单胞菌MY1402中进行卡那霉素耐受浓度分析,结果显示阳性转化子MY1402/pUE1的最高耐受浓度为250 mg/L,而且在相同抗生素浓度下培养温度从28℃降到15℃并不影响转化子MY1402/pUE1的生长,表明pUE1中的插入片段p1具有低温启动子的活性.将所预测的p1核心序列p1a通过化学合成并连接到探针载体pUE上,构建出重组质粒pUE1a并转化MY4102中进行功能分析.结果显示,28℃条件下p1a片段仍保持相同强度的启动子活性,但15℃条件下活性下降明显,卡那霉素质量浓度高于100 mg/L基本没活性,表明p1a两端序列可能与p1低温转录启动活性有关.     

抗汞菌株的筛选及质粒的研究

测定了自污染地区分离到的抗３０μｇ／ｍＬＨｇＣｌ２的８７株细菌中有３９株具有质粒带，将它们分为４种类型，其中汞盐抗性质粒可以转移。     

沼泽红假单孢菌的分离鉴定研究

N菌株是从太原杨家堡污水处理厂污泥中分离获得,纯培养物经形态学、细胞超微结构,生理生化、DNA G+C mol％含量等特征的分析鉴定,以伯杰系统细菌学手册第一版第三卷为根据,确定该菌株为沼泽红假单孢菌。并且根据紫色非硫细菌类群的特点,对其主要分类学特征进行了讨论。     

红假单胞菌的分离鉴定与生长特性

由青岛沿岸潮间带表层沉积物分离出４株光合细菌，经鉴定属于荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌。光照厌氧培养生长实验表明ＨＤ３的最适盐度为Ｓ＝１５－２５，ＰＳ２－２为一淡水菌株。菌株ＨＤ３的最适ＰＨ范围为６．３５－８．３。ＨＤ３、ＲＳ均不能利用硫化物且其生长受较高浓度的硫化物抑制。     

嗜麦芽假单胞菌质粒pSH1的限制图谱及km^r标记的克隆

对嗜麦芽假单胞菌Ｐ２菌株的质粒ｐＳＨ１进行了限制酶切分析，确定了Ｂｇ１ Ⅱ，ＥｃｏＲ Ⅰ，Ｐｓｔ Ⅰ，Ｘｂａ Ⅰ，ＢａｍＨ Ⅰ，Ｂｇｌ Ⅰ，及Ｐｖｕ Ⅱ共７种限制性内切酶在ｐＳＨ１，质粒上的切割位点，前４种酶均为单一切点，后３种依次为２，７，５个切点。通过双酶切和部分酶切的方法绘制了ｐＳＨ１质粒的限制酶切图谱。将ｐＧＰ１－２质粒上的卡那霉素抗性基因片段插入ｐＳＨ１，获得了重组质粒ｐＳＨ２．ｐＳＨ２     

重组质粒pPAHD1的限制性内切酶图谱分析

本文对我们构建的含有青霉素酰化酶(Acylace)基因的重组质粒pPAHD1进行了限制性内切酶图谱的测绘。使用了限制酶14种,证明BglⅡ,SalⅠ,SmaⅠ和BamHⅠ在重组质粒上各有切点一个;EcoRⅠ有切点两个:HindlⅡ,AvaⅠ各有切点三个;PvuⅠ有切点四个;EcoRⅤ和XmnⅠ各有切点五个。     

解酚假单胞菌的分离及毒物降解的特点

在假单胞菌中有些株可以降解芳香类有机物,另一些株可以抗重金属.某些芳环化合物如苯酚等,及含汞的化合物都是可以造成环境污染的有毒物质.对假单胞菌降解水杨酸等芳香化合物的途径已有一些了解,但少有涉及代谢的调控问题.本文报道一株从化学工业污染区域新分离到的假单胞菌.这株菌不但可以降解水杨酸、苯甲酸及邻苯二酚,而且还能降解毒性较强的苯酚,并具有耐受一定浓度Hg~(2+)的能力,是一株有前途的去污染工程菌.对该菌降解混合芳香化合物的研究发现,邻苯二酚在这些芳香化合物降解代谢中是一个具有调节作用的物质.     

短小芽孢杆菌质粒pCJ3的衍生质粒pAl32的酶谱及抗性基因定位

从短小芽孢杆菌四环素抗性质粒pCJ3截短的衍生质粒pAL32,经用6种限制酶双酶解试验,根据琼脂糖凝胶电泳带估算各片段的分子量,作出了pAL32的6种限制酶图谱。利用已除去复制功能的金黄色葡萄球菌质粒pUB110与pAL32构建的Km~rTc~r的双抗性重组质粒pSC33为载体,在EcoRV位点克隆的λDNA片段的重组子均为Km~rTc~s。用pUB110与pAL32在PvuⅡ位点连接后的重组质粒也为Km~rTc~s。根据这些重组子四环素抗性的失活,推知pAL32上EcoRV与PvuⅡ切点均位于其四环素抗性基因上。     

质粒pATZ-1的纯化和分子大小的测定

通过 CsCl- EB( 溴化乙锭) 密度梯度离心, 从降解除草剂阿特拉津的假单胞菌 AD1 菌株中分离并纯化出质粒pATZ- 1. 该质粒经 EcoRI消化产生 14 个限制片段, 以DNA 的 Hind片段为分子大小的标准,用作图法测出上述14 个片段的大小之和即pATZ-1 的分子大小为125 kb.     

甘薯薯瘟病原细菌对甘薯植保素的诱导初探

甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）抗病品种“湘薯６号”和感病品种“新种花１８３”经薯瘟病原细菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｏａｒｕｍ Ｅ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ）的诱导，９０％甲醇提取后，用乙酸乙酯萃取和ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０柱层析分离纯化得到４个吸收峰，经抑菌试验检测出“湘薯６号”的抑菌活性区在第２峰，而新种花１８３的抑菌活性区在第３峰，硅胶Ｃ２５４薄板层析法鉴定该提取物可能是植保素     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌的分离及耐药性分析

目的 了解烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌耐药谱的变化,为防治烧伤病区患者感染铜绿假单胞菌提供合理用药依据.方法 常规方法收集同一时间烧伤病房9名感染患者的患部浓汁和血液标本,分离鉴定出9株铜绿假单胞菌,K-B法进行药敏试验及统计学分析.结果 9株铜绿假单胞菌对氨苄西林、哌拉西林、亚胺培南/西司他丁、头孢他啶、氨曲南、阿米卡星、复方磺胺等11种抗菌药物耐药率均为100%.结论 烧伤病房感染患者铜绿假单胞菌耐药现象严重,应注意铜绿假单胞菌耐药性的监测.     

貉源铜绿假单胞菌主要生物学特性鉴定

从河北省昌黎地区某养貉场自然病死貉的肺脏中分离到几乎纯一的细菌,经对10株分离菌进行细菌形态学观察、培养特性、理化特性等主要生物学特性鉴定,结果表明,该分离菌为铜绿假单胞菌。药物敏感性试验表明,该分离菌对丁胺卡那霉素、头孢氨苄、环丙沙星敏感。经用小白鼠进行致病性试验,证实所分离到的该菌有致病性。     

实验动物绿脓杆菌的检测方法研究

目的研究和建立实验动物及环境样品绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)快速、准确的鉴定方法。方法分别用VITEK2 Compact全自动分析系统和常规生化方法对绿脓杆菌参考菌株、绿脓杆菌分离株和恶臭假单胞菌分离株进行鉴定试验,并比较不同鉴别培养基的鉴定效果。结果可以用PIA琼脂培养基/CFC琼脂培养基和乙酰胺琼脂培养基为鉴定培养基,采用以氧化酶、明胶液化和42℃生长试验为主的常规鉴定方法,也可采用VITEK2Compact全自动微生物分析系统直接鉴定绿脓杆菌或将其用于常规鉴定结果的确认。结论 VITEK2 Compact全自动微生物分析系统适于绿脓杆菌快速、准确的鉴定或用于对常规鉴定结果的确认。