重组人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白的可溶性表达、纯化和对肿瘤细胞的抑制活性

以人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）为研究对象,根据大肠杆菌密码子偏好性优化,通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列,连接至pET-24b载体中,并转化入大肠杆菌BL21 (DE3)及BL21 ( DE3) plyS中进行诱导表达。结果显示,在含有2 mg/mL葡萄糖的LB培养基中37 ℃培养至OD-600约为0.6 h,加入0.2 mmol/L IPTG在30 ℃诱导2 h后,重组蛋白可以实现可溶性高表达。工程菌经超声波破碎、高速离心后,经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白,蛋白纯度达到95 %以上,蛋白最终得率在2.6 mg/g菌体。重组蛋白经IC-50检测,可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白L基因片段的克隆及高效表达

 采用PCR方法扩增HSV-1病毒型特异性包膜糖蛋白L(gL)基因片段并克隆至原核表达载体pGEX-5X-1获得重组质粒pGEX-5X-1-gL,将重组质粒转化E.coli BL21表达菌后经IPTG诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE蛋白检测表明,在分子质量56 ku处有HSV-1 GST-gL融合蛋白的高效表达,通过IPTG浓度筛选和诱导前表达菌扩增培养时间的比较分析对诱导条件进行了优化,GST-gL融合蛋白表达量可达到菌体蛋白总量的48.65%.Western blot中利用HSV-1灭活病毒获得的多克隆抗体确证所表达蛋白为HSV-1病毒组分.这一表达系统的建立和优化对进一步探讨HSV-1 gL蛋白功能及其免疫原性提供了有利条件.     

hIL-2／IFN-1嵌合基因原核表达质粒的构建与表达

为构建hIL 2 /IFN γ 嵌合基因原核表达质粒 ,筛选其高效表达工程菌 ,设计特异性引物 ,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEXHTb质粒NcoⅠ /HindⅢ位点 ,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆 ,IPTG诱导工程菌后以SDS PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况 ,并测定其抗原性和生物学活性 ,结果成功构建了工程菌Top10F’[hIL 2 /IFN γ],经优化表达条件后 ,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的 30 % ,分子质量约为 34ku .ELISA和Western blot实验结果表明 ,目的蛋白能特异性结合抗IFN γ 抗体 ,呈阳性反应 ,生物学活性测定显示其IL 2和IFN γ 比活性分别为 1 7× 10 7U/mg与 3 2× 10 6 U/mg .     

hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒的构建与表达

为构建hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒,筛选其高效表达工程菌,设计特异性引物,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEX HTb质粒Nco Ⅰ/HindⅢ位点,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆,IPTG诱导工程菌后以SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况,并测定其抗原性和生物学活性,结果成功构建了工程菌Top1O F'[hIL-2/IFN-γ],经优化表达条件后,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,分子质量约为34 ku.ELISA和Western-blot实验结果表明,目的蛋白能特异性结合抗IFN-γ抗体,呈阳性反应,生物学活性测定显示其IL-2和IFN-γ比活性分别为1.7×107U/mg与3.2×106U/mg.     

定向射向癌细胞的“子弹”—绿脓秆菌外毒素A

绿脓杆菌能分泌多种具有剧毒的毒素,它既能致病也可杀灭使人致病的细胞。利用绿脓杆菌分泌出来的毒素去杀死肿瘤细胞是当今肿瘤治疗的研究热点之一。本期朱海兵等撰写的“F3重组毒素的克隆表达与纯化”,就是有关利用绿脓杆菌毒素构建杀死肿瘤细胞靶向治疗系统的一篇学术报告。在一个杀死肿瘤细胞的靶向治疗系统中,     

F3重组毒素的克隆表达及纯化

以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选,获得含有F3的PQE80L重组载体的克隆.提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区,PE40.然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体.转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40.结果显示,大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量大概占菌体总体蛋白量的20%.通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为大规模表达、纯化F3-PE40的进一步功能奠定了基础.     

重组免疫毒素GnRH-PTD-PE39KDEL的构建及表达

通过引入蛋白质转导域（PTD）,提高免疫毒素人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）对肿瘤细胞的杀伤活性。设计了3条引物,通过2轮PCR在GnRH PE39KDEL基因的人促黄体激素释放激素C端和绿脓杆菌外毒素A衍生物N端引入PTD,获得GnRH-PTD-PE39KDEL基因经酶切后插入pET-His载体,并转化至BL21( DE3)中。采用镍离子螯合层析法纯化诱导表达样品,并进行了生物活性测定。成功构建了免疫毒素表达载体pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL;诱导产物可以实现可溶性表达;表达产物占菌体总蛋白的20%,靶向融合蛋白引入PTD后对人乳腺癌MCF-7细胞的IC50为0.860 μg/mL,表明较GnRH-PE39KDEL生物活性增强。成功地表达了融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL,为其进一步大规模表达、纯化和功能研究奠定了基础。     

细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体融合蛋白的构建及表达

用RT-PCR方法从人胎肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因,并用酶切连接方法将其与抗人AFP嵌合抗体拼接,连接到质粒pVITRO上,构建真核表达载体.将重组质粒转染CHO细胞,以RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测融合蛋白的表达.结果显示稳定转染细胞株有约150kDa的融合蛋白表达.     

小鼠单纯疱疹病毒Ⅰ型心肌炎与心肌细胞凋亡和c-Myc蛋白表达的关系

为了探讨小鼠单纯疱疹病毒Ⅰ型心肌炎与心肌细胞凋亡和cMyc蛋白的表达的关系,给BALB/C小鼠腹腔接种单纯疱疹病毒Ⅰ型以诱发其急性病毒性心肌炎(VMC),感染病毒3～35天后,VMC检出率为91.67%。应用电镜、原位末端标记法(TUNEL)及免疫组化技术检测发现,感染鼠心肌中有细胞凋亡和cMyc蛋白的表达,二者阳性率分别为78.33%和81.67%,凋亡细胞阳性指数(AI)范围在34.14±11.56～26.41±10.2之间。细胞凋亡和cMyc蛋白可能参与VMC的发生与发展。     

细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体融合蛋白的构建及表达

用RT-PCR方法从人胎肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因,并用酶切连接方法将其与抗人AFP嵌合抗体拼接,连接到质粒pVITRO上,构建真核表达载体。将重组质粒转染CHO细胞,以RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测融合蛋白的表达。结果显示稳定转染细胞株有约150kDa的融合蛋白表达。     

铜绿假单胞菌耐药机理

铜绿假单胞菌是耐药性十分突出的一类院内感染条件致病革兰氏阴性细菌．本文从生物被膜、细胞密度依赖式毒力因子、外排系统、基因盒一整合子系统及铜绿假单胞菌噬菌体几方面对其耐药性机理进行了概述，并提出了未来对微生物耐药性研究和应用的一些策略。     

北京地区2008～2011年实验动物绿脓杆菌检测结果与分析

目的了解SPF级实验动物中绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）感染现状和规律,为防止绿脓杆菌感染提供依据。方法参照国家标准,对SPF级小鼠、大鼠、豚鼠和兔进行检测。结果在2008～2011年中检测的SPF级动物中,PA感染的阳性率为8.9%（267/2988）;不同动物感染率无显著差异;不同时间（不同年份和不同季度）PA阳性检出率无显著差异;其中,免疫缺陷动物的PA阳性检出率为32.5%明显高于免疫功能正常动物的7.6%;PA检出率随着送检单位和动物数量的增加逐年升高;不同动物群体间感染率相当,且保持稳定。结论北京地区SPF级实验动物中PA检出率较高,应加强管理。     

铜绿假单胞菌液体发酵产生絮凝现象的研究

对铜绿假单胞菌液体发酵产生的絮凝现象进行了研究。初步确定其由铜绿假单胞菌产生的生物膜引起,测得生物膜中多糖含量约为6.3%,蛋白质含量约为7.7%。考察了添加颗粒营养物质豆饼粉对絮凝现象的影响,分析了天然群体感应抑制剂水杨酸、丁香酚、儿茶素、姜黄素和大蒜提取物对生物膜和菌浓的影响以及群体感应淬灭酶对菌浓的影响。结果显示,添加颗粒营养物质对絮凝物影响不显著;天然群体感应抑制剂不能显著提高铜绿假单胞菌液体发酵菌浓,但对生物膜的分散具有一定作用;群体感应淬灭酶对铜绿假单胞菌液体发酵浓度无显著影响。     

实验动物绿脓杆菌的检测方法研究

目的研究和建立实验动物及环境样品绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)快速、准确的鉴定方法。方法分别用VITEK2 Compact全自动分析系统和常规生化方法对绿脓杆菌参考菌株、绿脓杆菌分离株和恶臭假单胞菌分离株进行鉴定试验,并比较不同鉴别培养基的鉴定效果。结果可以用PIA琼脂培养基/CFC琼脂培养基和乙酰胺琼脂培养基为鉴定培养基,采用以氧化酶、明胶液化和42℃生长试验为主的常规鉴定方法,也可采用VITEK2Compact全自动微生物分析系统直接鉴定绿脓杆菌或将其用于常规鉴定结果的确认。结论 VITEK2 Compact全自动微生物分析系统适于绿脓杆菌快速、准确的鉴定或用于对常规鉴定结果的确认。     

铜绿假单胞菌中RND外排泵功能的研究

目的铜绿假单胞菌的耐药性与细胞膜的低通透性和膜上存在的RND外排泵有关,而且RND外排泵起主导作用。方法利用发光杆菌的荧光素酶基因操纵子luxCDABE为报道子,对铜绿假单胞菌基因组中所有的12种已知和可能的RND外排泵基因进行了系统的研究。结果低于抑制浓度庆大霉素对PAOC和PAOI有明显的调节作用。低于抑制浓度四环素对PAOJ调节作用,但属于同一类抗生素的土霉素却没有调节作用。α-氨苄青霉素对12个RND外排泵中的11个都有明显的调节。结论这些RND受不同类型抗生素调节并将它们向外排出。外排泵所向外排出的物质如抗生素,在结构上没有可识别的相关性。其中一个由基因PA2520,PA2521和PA2522组成的RND外排泵,不仅能够向外排出锌离子,而且还能向外排出抗生素。     

铜绿假单胞菌的LexA蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白LexA进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化.方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的LexA基因,将此基因片段插入到表达载体pET32a( )上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.包涵体洗涤后用8 mol/L尿素溶解,以镍离子亲合柱层析作为第1步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第2步精细纯化,反相高相液相色谱法(HPLC)测定蛋白的浓度.结果:LexA以包涵体形式表达,表达量为45%,经镍离子亲合柱层析纯化后LexA蛋白纯度达到85%以上,回收率大于80%,镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析两步纯化目的蛋白,经HPLC测定,最终目的蛋白的纯度为98.97%.结论:在pET32a( )表达系统中实现了PA的LexA蛋白的高效表达,两步纯化法获得高纯度的目的蛋白,为进一步鉴定LexA靶位点奠定了基础.     

紫外诱变选育优势铜绿假单胞菌菌株

采用紫外照射的方法对铜绿假单胞菌菌株进行诱变,从中筛选出一株优势正突变菌菌株B2,并对其形态,生长条件及产鼠李糖脂能力进行了研究。研究发现,相对于亲本B0,菌株B2产鼠李糖脂产量大幅度增高,从0.82 g/L增加到2.71 g/L。菌株形态为杆状菌。最佳生长条件为:温度为30℃,甘油30 g/L,酵母膏2 g/L,微量元素5 m L/L。研究结果表明从重金属含量高的制革污泥中筛选得到的铜绿假单胞菌经紫外诱变后可显著提高产鼠李糖脂产量,并进一步确定诱变后的菌株产鼠李糖脂的最佳发酵条件,为鼠李糖脂的量产提供理论基础。     

铜绿假单胞菌医院感染流行病学分子研究及基因分型

目的建立随机扩增多态性DNA（RAPD）基因分型方法检测铜绿假单胞菌（PA）,调查铜绿假单胞菌医院感染流行病学的情况,为控制院内感染提供直接可靠的参考依据。方法对2008—2009年分离的180株铜绿假单胞菌进行统计分析其临床分布;通过抗生素敏感性试验进行抗菌谱分型;再采用PAPD基因分型方法进行分析。结果标本主要来自ICU、烧伤科、呼吸内科等。从痰液标本中分离的铜绿假单胞菌占58．9％,其次伤口分泌物标本占18．9％、中段尿16．7％,其它类型标本占5．5％。抗菌谱分型分为5型。180株铜绿假单胞菌用RAPD分型共得178株,分型率98．9％（178／180）,分为9种类型：Ⅰ～Ⅸ。结论RAPD分型技术对铜绿假单胞菌临床分离株分型率较高;同一抗菌谱型的基因型可能不同,同一基因型的抗菌谱也可能不同。     

铜绿假单胞菌产吩嗪类色素的分离纯化及其对赤潮生物生长的影响

.从胜利油田被原油污染的土壤中富集分离得到菌株O 2 2,经鉴定属于铜绿假单胞菌.菌株O 2 2在海水培养基中能生长良好且能分泌色素类代谢产物.细菌发酵液经氯仿萃取并通过硅胶色谱柱分离得到桔黄色和蓝色两种色素.抑藻实验结果表明:黄色色素在较低浓度下对赤潮异湾藻以及具齿原甲藻0201 01两种典型的赤潮生物的生长表现出了明显的抑制作用(EC50<2mg·L-1),而在相同实验条件下,对非赤潮生物青岛大扁藻的生长影响不大.蓝色色素在低浓度下对藻细胞生长影响不明显(EC50>50mg·L-1),但在碱性条件下可经水解转变为黄色色素.可见,该细菌的色素代谢产物在赤潮治理中具有很好的应用前景.进一步借助紫外以及GC MS测试手段对抑藻物质进行了结构分析,结果表明两种色素为吩嗪类化合物,并认为黄色色素的抑藻作用是由于其中含有1 羟基吩嗪.     

铜绿假单胞茵主动外排系统与耐药性关系的研究

铜绿假单胞菌是一种重要的院内感染条件致病菌,常感染癌症患者、烧伤患者等机体免疫力低下的患者,它对多种不同理化性质的药物高度耐药,其主动外排系统在耐药性中起主要作用.主要研究了铜绿假单胞菌主动外排泵的类型、组成及对抗生素耐药性的影响.