单增李斯特菌的检测方法研究进展

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是全世界普遍公认一种重要的人畜共患食源性致病菌,其广泛存在于各种乳制品、蔬菜、肉类等食品中,对人的健康安全造成了极大的威胁.因此,如何有效地检测出单增李斯特菌的存在是食源性疾病预防与控制的关键环节.介绍了单增李斯特菌的传统检测方法以及各种快速检测方法(免疫学方法、生物传感器、基于噬菌体检测方法和分子生物学方法).     

单增李斯特氏菌快速鉴定技术的研究

目的:建立单增李斯特氏茵快速鉴定技术;方法: 选择Hly、Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增;结果: 单增李斯特氏菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特氏菌均扩增出两奈明显条带,其它食品中常见致病菌及非增李斯特氏菌均不见扩增条带.52株李斯特氏茵生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%(P＞0.5;X2=0.5).结论: 本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感性强、特异性高的单增李斯特氏茵鉴定方法.     

单增李斯特菌致流产小鼠子宫中Th1和Th2细胞因子的变化

为探讨Th1和Th2细胞因子在单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)致小鼠流产中的作用,用LM感染妊娠小鼠和小鼠巨噬细胞,统计胚胎存活率,酶联免疫测定(enzyme linked lmmuno sorbent assay,ELISA)小鼠子宫组织中和巨噬细胞培养基中主要的Th1和Th2细胞因子水平.结果显示,LM诱导的流产小鼠子宫中Th1细胞因子水平显著增加,溶血素O(listeriolysin O,LLO)基因缺陷型(Δ hly)LM感染组胚胎存活率和子宫中Th1、Th2细胞因子水平无显著变化;LM感染的巨噬细胞分泌的Th1细胞因子和白细胞介素-4(interleukin, IL-4)水平显著增加,IL-10水平显著降低,Δ hly LM感染组Th1和Th2细胞因子水平无显著变化.因此,LM感染后子宫中Th1/Th2细胞因子失衡诱导了小鼠流产,这可为临床防治LM诱导的流产提供科学依据.     

单增李斯特菌新疆临床分离株毒力基因的克隆和序列分析

为了研究单增李斯特菌新疆羊源临床分离的4b血清型菌株(简称LM90)毒力基因的变异情况,参考Genbank上收录的单增李斯特菌4b血清型菌株F2365(GeneBank登陆号AE017262)的Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因序列,分别设计引物,对LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的最大开放阅读框进行PCR扩增,回收基因序列,连接到PMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行序列的测定,将序列提交到NCBI上(登录号分别为KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612),测序后用DNAMAN软件对序列进行分析。结果显示:LM90的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ与F2365毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的同源性分别为98.04%、96.53%、98.20%、96.41%、98.23%,氨基酸的同源性分别为99.73%、99.83%、98.67%、99.66%、99.76%,可见单增李斯特菌新疆临床分离株LM90毒力基因Ami、Auto、InlB,InlC、InlJ序列相对稳定。     

天然植物提取物对鸡肉肠中单增李斯特菌及产品特性的影响

选择替代硝盐的商业化天然植物提取物T4NW S、DV和CS,以低温鸡肉肠为对象,通过微生物挑战实验(MCT)对其抑制单增李斯特菌效能进行了研究,并进一步分析了天然植物提取物对鸡肉肠产品特性的影响.结果表明:所选取的植物提取物对单增李斯特菌抑制效果尽管略低于传统的"亚硝酸钠+双乙酸盐(SD4)+异抗坏血酸钠"经典组合,但完全可替代硝盐显著的抑菌作用.本实验中0.6%T4NW S+0.5%CS组合,以及1.0%DV和0.5%CS+0.5%DV,均呈现与硝盐相同的抑菌效果,而且不同类型的抑菌剂的复合使用显现了互作效应,如1 mg/kg Nisin+0.5%DV的抑菌效果远远优于1.0%DV或2 mg/kg Nisin.进一步的产品特性分析显示,植物提取物可替代传统硝盐的发色作用,其中T10组的a*值甚至略高于添加硝盐产品.随着贮藏时间的延长各组值均有所下降,但添加了植物提取物的产品下降度更低,尤其是DV和T10+DV组显著更佳.各组别aw、p H值、质构等检测结果未呈现显著差异.     

食品源单增李斯特菌喹诺酮类抗生素耐药机制研究

以945株食品源单核细胞增生李斯特菌(Listeria monoocytogens,LM)作为研究对象,分析其对喹诺酮类抗生素耐药的分子机制。采用KB法筛选出喹诺酮类耐药的LM,利用PCR检测喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region,QRDR)的基因突变以及质粒介导喹诺酮耐药(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)基因的分布情况,结合最小抑菌浓度(MIC)值和外排泵抑制剂利血平分析其外排泵的作用,多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)结合血清组对耐药菌株进行遗传多样性分析。结果表明:32株耐药菌株中gyrA、gyrB、parC与parE的QRDR均未发生氨基酸突变,且未检测到PMQR相关基因;而7株fepR基因发现新的氨基酸突变位点,其作用机制有待阐明;外排泵基因lde在耐药LM中皆有检出,78.1%(25/32)LM加入利血平后MIC值降低至原MIC的1/2以下,lde可能是导致LM对喹诺酮耐药的重要因素。血清组分析发现32株耐药菌株分属血清组I.1、I.2、II.1、II.2和III,MLST共分为10种ST型,其中ST87、ST9和ST8为优势株,具有一定的致病能力。结果表明,lde是LM产生喹诺酮耐药的重要因素,但LM潜在喹诺酮耐药分子机制仍有待阐明,同时其潜在的致病性应引起重视。     

小鼠胚泡内细胞团分离方法的研究

以小鼠的早期胚胎为研究对象，对免疫手术分离内细胞团技术中抗血清制备，效价测定，胚胎毒性实验和免疫手术程序等关键问题做了较详细的论述，用一步法和二步法免疫手术分离的内细胞团经２４ｈ体外培养后的成活率分别为８３．６％和８９．３％。经小鼠嵌合体制备研究证实，改进的一步法免疫手术、操作简单，省时省力，有较强的实用性。     

单核细胞增多性李斯特菌的脉冲场凝胶电泳分型研究

用限制性内切酶Sma Ⅰ和Apa Ⅰ分别对21株单核细胞增多性李斯特菌菌株基因组DNA进行酶切,用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法进行遗传多样性分析。结果表明：3株临床分离株（00181、00174和0194）分别存在于亚型A、B、D中;16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株主要存在于4个亚型中,其中2个亚型（C、D）均为奶相关分离株（包括原料奶、均质奶（储奶罐）和成品奶分离株）,而加工厂地面污水分离株为独立的一个亚型（A）。     

海鱼中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检测

检测了来自4个商场的20种海鱼,共120个样品,按3管MPN计数法每100 g鱼肉中李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的平均值分别为396.72和214.78,平均出现率各为80.8%和43.3%,其中4月份的李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌数量远高于其它月份;按季节分,则各数值从大到小依次是春季、秋季、夏季和冬季;检测次数在3次以上的不同种类海鱼中都有李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检出,其数量和出现率与海鱼的种类密切相关,其中海鲶中的感染最严重;各个商场的海鱼都有李斯特氏菌和单核细胞增生李氏菌的检出;所分离的单核细胞增生李氏菌的血清型以1型和4型为主。     

基于ActA基因的单核细胞增多性李斯特菌的序列分型研究

根据单核细胞增多性李斯特菌ActA基因序列保守区设计一对引物,对21个菌株进行PCR扩增,得到长度为820bp的片段。PCR产物经过纯化后直接测序,并对其中的506bp进行同源性分析。结果表明单核细胞增多性李斯特菌分离株具有5个明显不同的克隆谱系,每个谱系的同源性均在95％～100％。16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株可被分成4个谱系,其中2个谱系（C、D）均为奶相关分离株和成品奶分离株;加工厂地面污水分离株为独立的一个谱系。初步表明,成品奶中污染的单核细胞增多性李斯特菌来自于奶牛场,而非加工环境。     

ERIC-PCR方法鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌研究

本研究工作共收集食物样品6种62份，从中分离单核细胞增生性李斯特氏菌可疑菌落，用ERIC PCR方法进行鉴定。并用国际生化方法验证，结果表明，两种鉴定方法结论完全一致，证明使用ERIC－PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌是可行的，并且耗时短，操作简单。     

河北省规模化猪场猪李氏杆菌的分离与鉴定

河北省某规模化猪场猪群发生李氏杆菌病,在试验过程中,采集病死猪的肝、脾等病理变化比较典型的病料,进行病原菌的分离培养与纯化,并对其进行鉴定。分离出了1株产单核细胞李氏杆菌。药敏试验表明,病原菌对庆大霉素和恩诺沙星极为敏感;动物接种试验表明,分离株具有较强的致病性,对雏鸡皮下接种、口腔接种和腹腔接种,小白鼠腹腔接种可引起发病,导致死亡。     

食品中单增李氏菌实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性，在对26种病原菌进行检测过程中，运用实时荧光PCR法和经典培养法进行比较，结果表明用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感、特异性更高。     

植物乳杆菌Y42无细胞培养上清抑制单增李斯特菌生物膜形成研究

为研究植物乳杆菌Y42无细胞培养上清对单核细胞增生李斯特菌(LM)生物膜形成的抑制作用,采用微孔酶标板刃天青显色法确定Y42上清的最小抑菌质量浓度(MIC),微孔酶标板结晶紫染色法检测Y42上清对LM生物膜形成的影响,软琼脂法测定Y42上清对LM爬行运动性的影响。结果显示Y42上清最小抑菌质量浓度为60mg/mL;当Y42上清作用质量浓度为MIC的1/32、1/16、 1/8、 1/4、 1/2时,LM的运动圈直径由81.15mm减小为78.31、 75.35、 69.51、 54.91、33.09mm,对LM生物膜形成的抑制率达到32.90%、 30.81%、 40.75%、 39.93% 、12.15%;普通光学显微镜在10×40倍放大倍数下,观察到Y42上清可显著减少LM在盖玻片上形成生物膜的量。Y42无细胞培养上清可通过抑制LM的运行性来抑制其生物膜的形成。     

单核细胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的构建研究

为了构建单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)ncRNA rli60基因缺失株,采用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法成功构建具有氯霉素抗性的pKSV7-Δrli60穿梭质粒,然后电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力下进行同源重组,通过PCR进行重组菌鉴定。结果表明:成功筛选得到遗传性稳定的LM ncRNA rli60基因缺失株,为揭示LM ncRNA rli60基因功能提供了研究材料;同时,为进一步研究其在LM致病性及环境应激中的分子机制奠定了基础。