转基因水稻植株再生及外源人α-干扰素cDNA的表达

本文使用转化脂介导转化法(Lipofectin-mediated transformation)成功地将含有人α-干扰素(Hu-α-IFN)cDNA以及与其连锁的新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)基因的E. coli质粒pIG3031导入到水稻(indica type rice)的原生质体内,并由此获得转化愈伤组织。基于Npt-Ⅱ酶活性的测定结果表明转化频率高达10％。筛选出的转化愈伤组织在分化培养基上再生出了完整的籼稻转基因植株。Southern杂交分析证明,外源Hu-α-IFN cDNA己整合到水稻基因组内;RNA条带杂交结果显示,外源Hu-α-IFN cDNA在T-DNA转录子1启动子(P1′)的控制下,在转化水稻细胞中有效地进行了转录;体外生物活性检测表明,转化植株组织抽提物中含有干扰素特有的抗病毒活性,说明外源Hu-α-IFN cDNA可在水稻细胞内正确表达。     

酵母高稳定载体的构建及人-αA干扰素在酵母中的高表达和分泌

本文利用酿酒酵母天然2μm质粒的SnaBI位点与pEMBL Yi27质粒的SmaI位点经平末端连接,构建成酿酒酵母高稳定质粒载体pHC11,经测定表明,其酵母转化子在非选择培养条件下连续生长50世代后,仍有82％的细胞保留该质粒,此结果证实了2μm质粒中非功能区的存在,将人-αA干扰素基因表达分泌单元插入pHC11,构建成重组质粒转化酵母后,在完全培养基中发酵培养,经分析测定,培养上清液中表达产物占总蛋白量的36.8％,干扰素效价达2.6×10~(10)u/L,表明利用高稳定载体pHC11使人-αA干扰素在酵母中得到了高表达和分泌。     

合成的人γ-干扰素cDNA在大肠杆菌的高效表达

合成了人γ-干扰素(IFN-γ)cDNA,其特点是选用了大肠杆菌偏爱密码子。将合成基因克隆到含P_L启动子的不同表达载体中,共获得9种不同的表达质粒,它们的SD与起始密码子ATG间的距离(D)不同,在起始翻译区(TIR)的最小自由生成能△G_(f298)~°不同,故其表达量的差异也很大。其中pLY_4-γ_5表达的IFN_γ的量占菌体总蛋白的60％—80％,为国际上所罕见。表达高的原因是由于选择(D)距离适当,△G_(f298)~°较高,以及选用的密码子较好。采用十分简便迅速纯化IFN-γ的方法分离包涵体可达90％以上纯度,再经一步分子筛柱层析,IFN-γ纯度即可达95％以上,比活约2.0×10~7IU/mg。     

疏水作用色谱法同时纯化及复性基因重组人干扰素-α

 使用高效疏水作用色谱直接从大肠杆菌表达的基因重组人干扰素 α(rhIFN α)包涵体的裂解液中纯化了rhIFN α ,并在纯化的同时获得了高的复性效率 ,使复性和纯化一步完成 ,大大地简化了操作步骤。用凝胶排阻色谱对该法纯化的rhIFN α进行了纯度测定 ,纯度达到 95 %以上。该法的活性回收率分别比稀释法和透析法高 1 0倍和 1 6倍。     

地衣杆菌α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

利用酵母MF-α1因子的启动子和信号序列构建载体并将缺失了启动子和信号序列的地衣杆菌α-淀粉酶基因重组进该载体上信号序列的下游,组建含α-淀粉酶基因的表达载体,经校正读码框架后实现α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达和产物的分泌;比较了酵母分泌的酶与在枯草杆菌中表达产生的酶的某些性质;讨论了基因表达和分泌的机制。     

人α-防御素基因克隆及其毕赤酵母表达的研究

为探讨人α-防御素(HNP2)酵母表达,根据HNP2氨基酸序列和巴斯德毕赤酵母密码偏爱性,设计HNP2基因序列片段,构建pGAPZαA-HNP2酵母表达载体,转化E.coliJM109,扩增重组子,经限制性核酸内切酶BlnI线性化,转毕赤酵母.PCR扩增挑选阳性转化子,SDS-PAGE分析酵母表达,利用阳离子交换树脂纯化HNP2,开展抗菌试验.结果显示转入巴斯德毕赤酵母HNP2基因得到表达,表达的HNP2具有显著的抗菌作用.     

新型免疫磁性微球的制备及其在α-2b干扰素分离纯化中的应用

采用琼脂糖、纤维素和聚乙烯醇3种材料制备表面带有活性羟基的新型磁性微球,对其性能进行了表征并探讨其致敏条件。通过性能的比较,选择纤维素磁性微球作为分离纯化载体,并建立α-2b干扰素的免疫磁性分离方法。通过对α-2b干扰素发酵菌体裂解液的预处理、上样量和稀释倍数以及洗脱条件进行考察,确立免疫磁性分离条件,用于α-2b干扰素的一步分离纯化,其活性回收率达到88%,平均比活性为1.5×108IU/mg,纯度大于99%。实验结果表明,纤维素磁性微球作为性能优良的新型磁性载体,更适于目的蛋白的免疫磁性分离。     

超声萃取-高效液相色谱法测定烟草中β-D-吡喃葡萄糖-3-氧代-α-紫罗兰醇苷

建立了一种用超声波辅助萃取-高效液相法测定烟草中β-D-吡喃葡萄糖-3-氧代-α-紫罗兰醇苷含量的新方法。以甲醇为萃取溶剂,超声萃取条件经过正交实验优化,优化后的条件为料液比1:40(m/V,g/mL)、萃取功率160W,萃取时间20 min。所得萃取液经大孔吸附树脂柱层析法分离后,用Waters SunFireC18(150 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱分离,紫外检测器(波长为243nm)检测,流动相为V(乙腈):V(水)=20:80;流速1 mL/min。β-D-吡喃葡萄糖-3-氧代-α-紫罗兰醇苷在0.01～1 mg/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.9994,相对标准偏差为1.8%,检出限为0.05μg/mL,平均回收率为87.80%。该方法适用于β-D-吡喃葡萄糖-3-氧代-α-紫罗兰醇苷的定量分析。     

重组人干扰素-γ的制备与鉴定

用聚乙二醇200疏水相互作用色谱固定相(PEG200-STHIC)分别在色谱柱和色谱饼上完成了一步复性并同时纯化来源于大肠杆菌(E.coli)表达的重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)。为了能使色谱分离方法用于不同来源的rhIFN-γ的纯化,对rhIFN-γ在反相色谱、离子交换色谱、固定化镍离子亲和色谱上的保留行为也进行了研究。色谱柱纯化的rhIFN-γ收集液经排阻色谱除盐和冷冻干燥得到rhIFN-γ干粉。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对rhIFN-γ干粉进行了测定,rhIFN-γ单体的相对分子质量为17184.0,二聚体的相对分子质量为34204.4。用细胞病变抑制法(CPEI)测定rhIFN-γ干粉的比活性为9.5×108 IU/mg。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定rhIFN-γ干粉的纯度高于95%。用色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ的质量回收率达到93.7%,纯度高于95%,比活性为4.3×107 IU/mg。结果表明,采用PEG200-STHIC色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ是一种十分高效的方法。     

过氧亚硝基阴离子对重组人干扰素α2b的氧化硝化修饰特征

在体外模拟研究体内氧化硝化应激状态下产生的过氧亚硝基阴离子(ONOO^－)对重组人干扰素α2b (rhIFN α2b)造成的氧化硝化修饰特征, 并利用HPLC-MS/MS分析方法鉴定了ONOO^－对重组人干扰素α2b氨基酸序列中的氧化硝化位点. 结果表明ONOO^－对重组人干扰素α2b的修饰位点主要在A螺旋的Met16被氧化, DE颈环的Tyr135被硝化, 以及 E螺旋的Trp140被硝化修饰.     

中国人ω1型干扰素基因的克隆、一级结构测定以及在大肠杆菌中的表达

采用聚合酶链反应(PCR)方法,从中国正常胎儿肝细胞染色体DNA中分离并克隆了人ω1型干扰素基因,测定了核苷酸全序列,表明原有争议的第88位密码子为GGA的核苷酸序列是正确的,因此该氨基酸为Gly。随后又利用PCR技术将所获的ω1型干扰素基因原始克隆改造成适于在大肠杆菌中表达非融合蛋白的结构形式,并以pBV220为载体在P_RP_L串联启动子控制下进行温控表达。表达产物的抗病毒活性达6.5×10~7单位/升菌液(O. D_600=0.75)。IFN-ω1不仅具有很高的抗病毒活性,同时在结构上与动物滋养层蛋白高度相似,而后者又是作为母体妊娠识别信号存在于多种动物体内的抗黄体退化蛋白,因此本文获得的这—ω1型干扰素基因及重组蛋白在理论和实际上都有进一步研究的价值。     

人乙肝病毒表面抗原基因在转基因烟草中的表达

本文报道了将乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原基因导入植物中并得到了表达。将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体pRoK Ⅱ的CaMV 35S启动子下游,构建重组质粒pRoK Ⅱ-HBs ag,将此质粒导入农杆菌LBA4404中,利用农杆菌感染叶盘的方法转化烟G-140品种,得到了抗卡那霉素的转化植株,并进一步获得了后代植株。酶联免疫分析表明转化植株及其后代均能产生具免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBS Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒。本文显示了用植物廉价生产HBs Ag的可能性。     

高效疏水作用色谱填料的合成及其在重组人干扰素纯化中的应用

高效疏水作用色谱（HPHIC）是利用不同蛋白质表面疏水区域与填料之间具有不同疏水作用进行分离的．由于HPHIC采用盐水体系作为流动相，配体采用极性的有机基团，使蛋白质可以在十分温和的条件下进行分离，且保持其生物活性基本不变[1，2]．自80年代中期以来，HPHIC在蛋白质的分离纯化上得到了广泛的应用．在90年代初期，随着基因工程技术的发展，HPHIC同时也被应用到基因工程的下游纯化技术上[3，4]．本文中我们合成了一OCH2CH3为端基的填料，检验了该填料的分离效果，并利用该填料对酵母菌表达的人αA-干扰素、大肠杆菌（E．col…     

O,O''''-二烷基-α-(取代苯并噻唑-2-基)氨基-(取代苯基甲基)膦酸酯的合成与抗烟草花叶病毒活性

采用无溶剂无催化剂合成方法,分别进行了以O,O'-二烷基亚磷酸酯、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、2-氨基取代苯并噻唑为原料的类Mannich一锅法合成反应研究,经合成筛选,优选出控制反应温度100℃,无溶剂、无催化剂加热反应120min的合成方法,实验结果表明该方法经济、简便、对环境友好.经元素分析,IR,1HNMR,13CNMR对所合成的化合物进行了结构确认和表征.培养并测定了化合物4a的晶体结构.初步生物活性测试表明,化合物具有一定的抗烟草花叶病毒活性.     

可修饰的内酯，α-氯甲基-α-甲基-β-丙内酯的合成和聚合

可修饰的内酯，α－氯甲基－α－甲基－β－丙内酯的合成和聚合＊王明霞李子臣贺晓晖杨丽＊＊李福绵（北京大学化学系北京１００８７１）关键词α－氯甲基－α－甲基－β－丙内酯，开环聚合＊１９９５－０２－２０收稿；１９９６－０３－１２修回：自然科学基金课题；＊＊...     

α-萘乙酸:植物生长的调节剂

α-萘乙酸是应用广泛的植物生长调节剂,它可以促进作物生长、疏花疏果、保花保果、促进生根等。介绍了α-萘乙酸的性质、合成方法、降解途径以及在农业生产上的应用和合成新型的植物生长调节剂。     

RP-HPLC法同时测定酒花中α-酸、β-酸和异α-酸

建立了RP-HPLC法同时检测酒花中α-酸、β-酸和异α-酸的主要异构体的方法。色谱柱为:EC 250/4 Nucleosil 100-5 C18,保护柱:CC 8/4 Nucleosil 100-5 C18,流动相A:水溶液(H3PO4 0.1%,0.2 mmol/L EDTANa2);流动相B:乙腈。流速为1.0 mL/min,双波长检测UV270 nm和UV315 nm,柱温30℃,进样体积10μL。方法加标回收率在90.0%～105.0%之间。方法可将酒花中α-酸、β-酸6种主要异构体和异α-酸3种主要异构体共9种物质一次性分离。     

不对称α-烃基-α-羟基丙二酰胺衍生物的合成新方法

N,N-二甲基氨甲酰基三甲基硅烷与一系列N-甲基-N-甲氧甲基α-羰基酰胺在无水无氧、105℃的条件下反应,合成了不对称α-烃基-α-羟基丙二酰胺类化合物或不对称α-烃基-α-三甲基硅氧基丙二酰胺衍生物,收率71%～86%,其结构用元素分析、1H NMR、13C NMR和IR等方法进行了表征.通过研究反应的影响因素发现,反应底物α-羰基酰胺中与α-羰基直接相连的烃基的空间位阻是该加成反应的重要影响因素,而α-羰基直接相连的芳环上取代基的电子效应则主要影响反应完成的时间.并提出了可能的反应机理.     

α-氯代丙烯酸甲酯和α-氟代丙烯酸甲酯的合成

合成了α-氯代丙烯酸甲酯和α-氟代丙烯酸甲酯两种单体,其结构经IR和^1H NMR表征。     

蛋白折叠液相色谱法中流动相对重组人干扰素-γ质量回收率的影响

蛋白折叠液相色谱法(PFLC)用于变性蛋白质复性并同时纯化时对流动相组成及其洗脱条件的要求远较通常的液相色谱法高。用端基为PEG-200的高效疏水作用色谱固定相对重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)进行纯化并同时复性,详细研究了流动相组成、梯度洗脱模式和流速对rhIFN-γ质量回收率和活性的影响。分别以3.0 mol/L (NH4)2SO4 +0.05 mol/L KH2PO4(pH 7.0)和0.05 mol/L KH2PO4(pH 7.0)为流动相A和B,采用35 min非线性梯度洗脱时,所得rhIFN-γ的质量回收率最高。