基于质谱技术蛋白质定量方法的研究进展

质谱技术已经成为目前蛋白质鉴定的重要工具。定量分析细胞内蛋白质组的动态变化,是当前研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标的迫切需要。本文综述了基于质谱技术蛋白质定量的策略、方法和应用等方面近年来的进展,评述了几种蛋白质质谱定量方法的特点和应用潜力。     

定量蛋白质组学质谱采集技术进展

质谱是定量蛋白组学的主要工具。近年来随着定量蛋白质组学研究的深入,传统质谱定量技术面临着复杂基质干扰、分析通量限制等诸多问题。而最近一系列质谱新技术的发展,包括同步母离子选择( SPS)、质量亏损标记、平行反应监测(PRM)、多重累积(MSX)和多种全新数据非依赖性采集(DIA)等,为解决目前蛋白质组学在相对定量和绝对定量分析方面的局限提供了有效途径。本文对定量蛋白质组学目前遇到的瓶颈问题进行了分析,总结了质谱定量采集技术的最新进展,并评述了这些新技术的特点以及在定量蛋白质组学应用中的优势。     

蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组分析方法进展

半胱氨酸的巯基具有很高的反应活性,作为亲核、氧化还原催化反应、金属结合及变构调节位点等在蛋白质的结构和功能中发挥着非常重要的作用,且容易发生多种翻译后修饰,调控亦或损伤蛋白功能,与人类许多重要疾病关系密切,因此,定性与定量分析蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组对理解其生物学功能具有重要意义。本文综述了近年来蛋白质半胱氨酸上常见的翻译后修饰组的质谱和蛋白质组学分析方法进展。     

蛋白质组驱动的精准医学研究进展

蛋白质是细胞的重要组成成分,参与人体各种代谢及生理功能的调控.蛋白质组学可以分析蛋白质表达水平、修饰状态和细胞内蛋白质相互作用,为研究这些分子在疾病发生和发展的不同阶段的变化提供了全局视角.近年来,临床蛋白质组学已被证实在疾病的早期诊断、预后和病情发展监测中发挥重要作用,并由此提出了蛋白质组学驱动的精准医学的概念.该文...     

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法的建立与优化

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件。在pH8.0的Na2B4O7/H3BO3缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全。对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点。结果表明:在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99,r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%。     

基于稳定同位素标记与质谱分析的蛋白质定量算法研究进展

蛋白质定量研究已成为蛋白质组学的热点,它是疾病相关生物标志物发现的重要途径.基于稳定同位素标记的质谱分析技术是蛋白质定量最常用的方法之一.随着实验方法的发展和改进,定量数据处理方法也在不断更新与完善.一般来说,定量数据处理包括四步:搜库鉴定、图谱定量信息提取与计算、肽段丰度比计算和蛋白质丰度比计算及差异显著性分析,其中后三步是数据处理的核心.目前,后三步中每步都有多种可选算法,这些算法一般都是针对特定实验技术而提出的,缺乏深入的工作对它们进行系统比较和优化.为此,在总结目前主要实验技术方法的基础上,论述了定量算法的现状和存在问题,并针对一些问题提出了可行的解决办法.     

18O稳定同位素标记定量蛋白质组研究技术的建立与优化

建立了18O稳定同位素标记方法,用于复杂体系蛋白质相对定量分析。对影响蛋白质标记稳定性的实验条件进行了比较和优化。结果表明,采用酶切后标记的方法,酶切肽段在胰酶催化下,在pH 5.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲体系中,37℃18O标记反应16 h,绝大部分肽段即可达到100%的标记效率。对多个16O/18O成对肽段峰强度的动态范围及定量准确度进行了考察。结果表明,18O标记方法是一种简便、稳定、可靠的相对定量方法,10倍动态范围内,标记率相对标准偏差在18.4%以内,16O/18O峰强度呈很好的线性关系。本实验考察了标记后的肽段在不同溶液体系中的稳定性,为复杂样品的预处理和预分离的溶液条件提供了依据。     

表达蛋白质质谱分析

对基因编码的蛋白质进行系统分析可以为注释基因组信息和研究疾病发生机理提供参考.质谱因其高通量、高灵敏度和高精度等特点成为蛋白质表达谱研究的核心技术.过去10年,质谱技术的发展大大促进了蛋白质表达谱的研究.本文综述了蛋白质表达谱的定性和定量研究进展,并展望了进一步的研究方向.     

基于生物质谱的定量蛋白质组学研究进展

随着蛋白质组研究和生物质谱技术的发展,大规模的蛋白质组相对定量和绝对定量已经成为了解生命活动进程、疾病发生发展过程以及生物标志物筛选和验证的重要策略,并形成蛋白质组学研究领域的一个重要分支：定量蛋白质组学.综述了近年来定量蛋白质组学的研究进展,并对其中的关键技术进行讨论.     

18O同位素标记定量肽段串联体蛋白质结合同位素稀释-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法

建立了定量肽段串联体蛋白质(concatamers of Q peptides, QconCATs)结合¹⁸O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法。首先对QconCAT重组蛋白质进行了纯度表征,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征结果表明重组蛋白质的纯度在99%以上,相对分子质量约为63.4 kDa。对QconCAT重组蛋白质酶切后的肽段混合物进行质谱分析,并经pFind和pLabel软件处理,验证了目标肽段。还考察了QconCAT重组蛋白质的酶切效率和¹⁸O标记效率,并对QconCAT蛋白质结合¹⁸O标记-同位素稀释-多反应监测质谱方法进行了评价。实验结果表明,采用该方法对腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis, TTE)中选定蛋白质的肽段进行绝对含量测定时,相对标准偏差小于20%,准确度较高,说明该方法可用于复杂生物样本中蛋白质的绝对定量。更重要的是所建方法不仅解决了细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术的重标试剂价格昂贵的问题,也为定量蛋白质组学提供了一种新的方法。     

基于质谱的蛋白质组学技术在食品真伪鉴别及品质识别方面的应用

蛋白质组学作为后基因组时代的一个新研究方向,近几年发展迅速,目前已应用于多个领域,在食品品质检测和安全控制方面成为有力的研究工具。蛋白质组学为食品科学的相关研究打开了新思路,不仅可以鉴定蛋白质种类,还可进行蛋白质定量,为分析不同物种、产地、成熟阶段的食品蛋白质组分和含量提供了可能。蛋白质组学研究手段多样,质谱是常用技术之一。该文介绍了蛋白质组学的概念、分类、研究技术以及常见蛋白质数据库,综述了基于质谱的蛋白质组学技术在真伪鉴别和品质检测方面的应用,涉及海鲜、肉制品、奶制品、保健食品及高附加值食品等多种食品,并对蛋白质组学的发展进行了展望。     

结构蛋白质组学研究进展

蛋白质结构与其生物学功能直接相关，蛋白质功能的调控也主要依赖于其构象和相互作用的动态调节。对蛋白质结构和功能的研究一直是生命科学领域的研究热点，也是当前蛋白质组学研究的重要发展方向。该综述重点讨论了近年来基于质谱的结构蛋白质组学主要分析方法的原理、进展和应用，主要包括非变性质谱法、限制性蛋白质酶切法、化学交联法、氢氘交换法、共价化学标记法、热稳定性分析法等；最后对结构蛋白质组学的发展进行了总结与展望。     

基于质谱的单细胞蛋白质组学分析方法及应用

细胞是生命体的最小组成单位,遗传及外部环境等因素使单细胞异质性广泛存在于众多生物体中。传统的生物学实验获得的结果多是大量细胞的平均测量值,因此在单细胞层面开展研究对于精确理解细胞的生长发育以及疾病的诊断与治疗至关重要。而作为重要的细胞和生命活动的执行者,蛋白质由于其不具备扩增特性,且种类繁多、丰度低、动态分布范围宽,与核酸等其他生物大分子相比,其单细胞组学研究相对滞后。而在所有的检测手段中,荧光检测以及电化学分析方法具有极高的灵敏度,但是囿于其研究通量有限,以及电化学活性依赖,很难成为普适性的单细胞蛋白质组学研究方法。质谱分析作为传统蛋白质组学中最为核心的研究技术,由于其高灵敏、高通量、结构信息丰富等特点,在单细胞蛋白质组学研究中独树一帜。该文综述了近年来基于质谱的单细胞蛋白质组学研究中的代表性方法,根据质谱分析前蛋白质分离方式的差异,将其分为基于毛细管电泳分离、液相色谱分离和无分离手段的直接检测3类方法,在介绍研究现状的同时对这些方法在细胞通量、蛋白质鉴定数目、灵敏度以及方法应用方面进行了总结与比较。最后,基于目前研究中面临的挑战以及发展趋势对基于质谱的单细胞蛋白质组学的研究前景进行了展望。     

基于毛细管电泳技术的高灵敏度蛋白质组学技术发展

近年来,蛋白质组学技术在样品前处理、分离技术和质谱检测技术方面获得了快速发展,已经可以实现在几小时内对上万种蛋白的同时定性和定量分析。然而,目前的主流蛋白质组学技术仍无法满足极微量生物样品,尤其是单细胞样品的组学分析需求。毛细管电泳分离技术具有峰宽窄、柱效高、样品用量少等优势,是与高分辨质谱在线联用的理想选择之一。该文评述了集成化和在线样品前处理以及主流的纳升液相色谱-质谱联用系统在高灵敏度蛋白质组学分析领域的发展现状和挑战,认为该领域的重要技术挑战之一在于目前的纳升液相色谱分离已经无法完全匹配现代高分辨质谱超过40 Hz的超高扫描速度,从而导致质谱使用效率的降低。针对上述技术挑战,该文重点探讨了毛细管电泳-质谱联用技术的独特技术优势和潜在发展机遇,主要包括:(1)面向微量酶解多肽样品的高柱效毛细管电泳分离。通过采用毛细管电色谱可以进一步改善毛细管电泳柱容量不足的局限;(2)面向高灵敏度分析的无鞘液/鞘液接口开发;(3)高效毛细管电泳分离与高扫描速度质谱检测的协同化使用。总之,我们预期毛细管电泳-质谱联用技术的进一步发展有望在针对单细胞等超微量生物学样品的蛋白质组学分析中获得更广泛的应...     

比较纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱用于自顶向下蛋白质组学

自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了先进的纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱平台用于自顶向下蛋白质组学分析。相对于纳升反相色谱-质谱而言,毛细管区带电泳-质谱可以将标准蛋白质样品的消耗量降低10倍,而且保持与纳升反相色谱-质谱相当的蛋白质信号强度。有意思的是,与毛细管区带电泳-质谱相比,纳升反相色谱-质谱可以获得更高的蛋白质分子的气相价态。这个现象可能是由于反相流动相中的高浓度乙腈使得蛋白质变性的更加充分。从1微克的大肠杆菌蛋白质样品中,毛细管区带电泳-串联质谱可以鉴定到159个蛋白质和513个蛋白质变体,而纳升反相色谱-串联质谱仅鉴定到105个蛋白质和277个蛋白质变体。当将大肠杆菌蛋白质的上样量提高到8微克时,纳升反相色谱-串联质谱可以鉴定到245个蛋白质和1004个蛋白质变体。由于纳升反相色谱-串联质谱具有比毛细管区带电泳-串联质谱更高的上样量与更宽的分离窗口,当蛋白质样品量不受限制时,纳升反相色谱-串联质谱具有明显的优势。但是,在痕量样品分析方面,毛细管区带电泳-串联质谱具有更大的潜力。     

单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展

单克隆抗体药物是一类以免疫球蛋白G的结构为基础的大分子糖蛋白药物,为癌症、自身免疫疾病以及病毒感染等多种疾病的治疗提供了全新的途径。单抗药物的糖基化修饰类型及水平对其稳定性、清除率、免疫原性、抗体依赖细胞毒性及补体依赖细胞毒性等都有一定的影响。单抗药物的迅速发展及其在多种疾病治疗中日益凸显的重要性都对单抗药物的研发及用药安全等方面提出了更高的要求。因此,建立规范可靠的单抗药物糖基化修饰分析方法有着十分重要的意义。该综述将简要介绍单克隆抗体药物糖基化修饰及相关的定性、定量分析方法。     

基于质谱检测的相关色谱技术在阿尔茨海默病诊断中的应用

随着世界老年人口的急速增长,阿尔茨海默病发病人数也逐年增多,已成为继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后威胁人类健康的“第三大杀手”。疾病的诊断和治疗同等重要,阿尔茨海默病诊断通常依靠典型的临床特征、神经影像技术以及检测疾病相关的生物标志物等。近些年来蛋白质组学和质谱技术迅速发展,可以利用这些技术寻找到与疾病相关的特异性的蛋白质分子作为早期诊断的生物标志物。本文就此进行了综述,主要包括基于蛋白质组学的诊断标志物的筛选和基于质谱检测的色谱技术在阿尔茨海默病诊断中的应用,引用文献34篇。     

Recent developments of nanoparticle-based enrichment methods for mass spectrometric analysis in proteomics

In proteome research, rapid and effective separation strategies are essential for successful protein identification due to the broad dynamic range of proteins in biological samples. Some important proteins are often expressed in ultra low abundance, thus making the pre-concentration procedure before mass spectrometric analysis prerequisite. The main purpose of enrichment is to isolate target molecules from complex mixtures to reduce sample complexity and facilitate the subsequent analyzing steps. The introd...     

薄层色谱与质谱联用的研究进展

薄层色谱(TLC)是一类非常实用的液相色谱方法,由于其装置简单、操作便捷、灵活、通量高、成本低,以及样品前处理简单等优点,在许多行业的检测中都有广泛的应用并扮演着重要的角色。随着现代检测技术的不断发展以及各种检测技术综合应用程度的加深,薄层色谱与质谱的联用(TLC-MS)也成为这一方法的重要发展方向。随着我国医药、食品、科学仪器等事业的不断发展和升级,相信薄层色谱-质谱联用技术可以起到更好的作用,并迎来发展的契机。该综述将目前薄层色谱-质谱的联用形式分为3类,一是接口仪器的间接联用,二是质谱对薄层板的原位检测,三是质谱对薄层分离过程的实时监测,并按此分类对典型的联用形式进行了总结和简要描述。随着薄层色谱-生物自显影技术的广泛使用,薄层色谱与质谱联用的技术方法极大地提高了食品、药用生物活性物质的研发效率。目前,薄层色谱与质谱联用发展的主要瓶颈是“即插即用”型部件的设计和商品化。具有实时监测功能,同时又兼备灵活扫描功能和高通量特点的TLC-MS技术也很令人期待。此外,不同种类TLC-MS解吸-电离技术的对比研究也是有待讨论的应用问题。     

毛细管电泳-质谱联用技术及其在蛋白质组学中的应用

蛋白质组学研究在生物学、精准医学等方面发挥着重要的作用。然而研究面临的巨大挑战来自生物样品的复杂性,因此在质谱（MS）鉴定技术不断革新的同时,发展分离技术以降低样品复杂度尤为重要。毛细管电泳（CE）技术具有上样体积小、分离效率高、分离速度快等优势,其与质谱的联用在蛋白质组学研究中越来越受到关注。低流速鞘流液和无鞘流液接口的发展及商品化推动了CE-MS技术的发展。目前毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等电聚焦（CIEF）、毛细管电色谱（CEC）等分离模式已与质谱联用,其中CZE-MS应用最广泛。目前被广泛采用的蛋白质组学研究策略主要是基于酶解肽段分离鉴定的"自下而上（bottom-up）"策略。首先,CE-MS技术对酶解肽段的检测灵敏度高达1 zmol,已成功应用于单细胞蛋白质组学;其次,毛细管电泳技术与反相液相色谱互补,为疏水性质相近的肽段（尤其是翻译后修饰肽段）的分离鉴定提供了新的途径。基于整体蛋白质分离鉴定的自上而下"top-down"策略可以直接获得更精准、更完整的蛋白质信息。CE技术在蛋白质大分子的分离方面具有分离效率高、回收率高的优势,其与质谱的联用提高了整体蛋白质的鉴定灵敏度和覆盖度。非变性质谱（native MS）是一种在近生理条件下从完整蛋白质复合物水平上进行分析的质谱技术。CE与非变性质谱联用已被尝试用于蛋白质复合体的分离鉴定。该文引用了与CE-MS和蛋白质组学应用相关的93篇文献,综述了以上介绍的CE-MS的研究进展以及在蛋白质组学分析中的应用优势,并总结和展望了其应用前景。